Author:

Abstract:

Gelatinase B behoort tot de matrix metalloproteinasen, een familie van m eer dan 20 enzymen. Matrix metalloproteinasen dragen een zinkion in het actief centrum en degraderen efficiënt componenten van de extracellulair e matrix. Gelatinase B heeft, naast zijn fysiologische functie, ook een pathologische impact in processen zoals invasie en metastasering van kan kercellen en antigeenbewerking bij autoimmuniteit. Een van de mogelijke verklaringen hiervoor is het feit dat gelatinase B naast extracellulaire matrixeiwitten ook atypische substraten klieft. Het REGA-model -een let terwoord dat staat voor ‘restepitopen genereren&n bsp;autoimmuniteit’- stelt in het licht dat extracellulaire proteo lyse van autoantigenen cruciaal kan zijn voor het induceren van een tole rantiebreuk tegenover lichaamseigen antigenen, meer bepaald door de vrij zetting van immunodominante epitopen die normaal ‘verborgen’ zijn in de drie-dimensionale structuur van het intacte molecule. Dit doctoraatsproj ect is gegroeid vanuit onze belangstelling naar een mogelijke rol van ge latinase B bij de ontwikkeling van de autoimmuunziekte (juveniele) type 1 diabetes. Type 1 diabetes ontstaat door autoimmuun-gemedieerde destructie van de&n bsp;ß cellen van de eilandjes van Langerhans, die instaan voor de a anmaak van insuline. Insuline is een sleutelmolecule voor het handhaven van evenwichtige bloedglucosewaarden en is tegelijkertijd een belangrijk autoantigeen. In type 1 diabetes ontwikkelt het immuunsysteem dus een i mmuunrespons tegen lichaamseigen insuline. Wij ontdekten dat insuline wo rdt afgebroken door gelatinase B tot welgedefinieerde, inactieve fragmen ten. Logischerwijze kan deze inactivatie rechtstreeks diabetogene conseq uenties hebben. De aard van de gevormde klievingsfragmenten levert echte r geen sluitende argumenten voor een eventuele implementering van het RE GA-model als verklaring voor de ontwikkeling van autoimmuniteit tegen in suline. Om de rol van gelatinase B verder te substantiëren in vivo, werd het eiw it gemeten in pancreasweefsels van proefdieren. Daarbij was het uiterst belangrijk om een onderscheid te kunnen maken tussen inactief 92 kDa ‘pr o’-gelatinase B en de 82 kDa actieve vorm. Gelatinezymografie is een tec hniek die dit toelaat. Om zymografische analysen te kunnen uitvoeren van complexe biologische stalen ontwikkelden we een elegante prezuiveringst echniek voor gelatinasen. Zonder deze techniek zijn analysen van gelatin ase B in de pancreas onmogelijk door de overweldigende interferentie van verteringsenzymen. In muizen waarin diabetes werd geïnduceerd door toed iening van de chemische component streptozotocine toonden we op deze wij ze aan dat gelatinase B verhoogd tot expressie komt in pancreasweefsel, kort na de inductie van diabetes. Het enzym is echter vooral aanwezig in zijn inactieve vorm en gelatinase B-knockout muizen zijn niet beschermd tegen de ontwikkeling van diabetes. Immunohistochemische analyse van gelatinase B in pancreasweefsel van pan creatitispatiënten duidt op een sterke expressie van het enzym in infilt rerende leukocyten en ductulaire cellen. Pancreatitis is een pathologie die refereert naar het exocriene deel van de pancreas, maar pancreatitis patiënten ontwikkelen opvallend vaak secundaire diabetes. Dubbelkleuring en voor insuline en gelatinase B toonden de expressie van de respectieve lijke eiwitten aan in cellen die rechtstreeks contact maken. Immunohisto chemische analysen geven echter geen uitsluitsel over de activatietoesta nd van het enzym. Om activatie van gelatinase B te bestuderen in pancrea sweefsel bij ontstekingen induceerden we pancreatitis in muizen. Hierbij toonden we aan dat de aanwezigheid van actief trypsine in de pancreas, een diagnostisch kenmerk van pancreatitis, gerelateerd is met de aanwezi gheid van actief gelatinase B. Bij deze studie ontdekten en beschreven w ij als eersten de in vivo activatie van gelatinase B door trypsine, een mechanisme dat tot hiertoe enkel in vitro werd gedocumenteerd. Deze resultaten, samen met de klieving van insuline door gelatinase B, sugge reren dat een diabetogeen effect door insuline-afbraak in het bijzonder van toepassing kan zijn bij pancreatitiden. Dit kan van belang zijn voor de ontwikkeling van secundaire diabetes. Bovendien kan de activatie van gelatinase B in de pancreas bij pancreatitis een mechanisme zijn die de verdere afbraak van de exocriene pancreas in de hand werkt. Daarnaast onderzochten we de rol van gelatinase in een diabetes-gerelate erde pathologie. Proliferatieve diabetische retinopathie is een microang iopathische aandoening van de retina bij diabetespatiënten waarbij de hy perglycemische toestand van het bloed leidt tot verdikking van de basale membraan van de retinale haarvaatjes en een versmalling van het lumen. Dit leidt tot een ischemische toestand die op zijn beurt de ontwikkeling van nieuwe bloedvaatjes stimuleert (neovascularizatie). Deze nieuwe haa rvaatjes groeien roekeloos vanuit de retina tot in het glasachtig lichaa m (corpus vitreum). Deze bloedvaatjes breken makkelijk waarbij bloed in het glasachtig lichaam terecht komt en een troebel effect veroorzaakt. W ij detecteerden geactiveerd gelatinase B in het glasachtig lichaam van p atiënten met proliferatieve diabetische retinopathie, meer bepaald en qu asi exlusief in patiënten met intravitreale bloedingen. Waarschijnlijk s peelt gelatinase B hier een rol in de afbraak van de basale membraan van de ‘nieuwe’ haarvaatjes, hetgeen uiteraard rechtstreeks bloedingen tot gevolg kan hebben. Eveneens in het oog, maar niet noodzakelijk in diabetici, toonden we aan dat gelatinase B nog een ander schadelijk effect kan hebben, namelijk h et onstaan van cataract. We vonden dat lenzen van muizen, die in cultuur worden gebracht, snel cataract ontwikkelen na toevoeging van gelatinase B aan het cultuurmedium. De klieving van ßB1 crystalline, een structurele component van de lens- ligt aan de basis van de geobserveer de vertroebeling. We demonstreren dat inductie van endogeen gelatinase B in het oog van muizen voldoende is om dezelfde klieving van ß B1 crystalline te induceren in vivo. Bij controle-inducties in gelatinas e B knockoutmuizen blijft het eiwit immers intact. Onze resultaten duiden op een diabetogene rol van gelatinase B, niet zoz eer als verwekker van autoimmuniteit, maar door directe vernietiging van insuline. Daarnaast tonen we aan dat gelatinase B schadelijk kan zijn b ij proliferatieve diabetische retinopathie en bij het ontstaan van catar act.