Author:

Abstract:

De ziekte van Crohn is een chronische inflammatoire darmziekte gekenmerkt door segmentaire, transmurale ontsteking die overal in de maag-darmtractus kan optreden. De ziekte komt vaak voor bij jongvolwassenen in de westerse wereld. Crohn kan medisch behandeld worden doch veel patiënten worden tenminste één maal geopereerd. De ziekte heeft dus een grote impact op de levenskwaliteit van de patiënten.De etiologie van Crohn is nog onbekend. Er is een consensus dat de ziekte ontstaat door een samenspel van genetische en omgevingsfactoren. Men heeft gesuggereerd dat de darmflora betrokken is bij het ontstaan van chronische ontsteking in personen die genetisch voorbeschikt zijn om Crohn te ontwikkelen. Hoe dit gebeurt, is echter onduidelijk. Drie hypothesen zijn vooropgesteld: (1) een persisterende infectie door een moeilijk uit te roeien ziektekiem; (2) grootschalige bacteriële translocatie, misschien secundair aan een toegenomen mucosale permeabiliteit; (3) “dysbiose”, d.i. een verlies van het normale evenwicht tussen protectieve en schadelijke bacteriën. Het doel van deze thesis was het vinden van bijkomende argumenten ten gunste van één van deze hypothesen. Gezien elke hypothese de aanwezigheid van individuele bacteriën of groepen micro-organismen in de darmwand veronderstelt, ontwikkelden we een nieuwe methode voor detectie en identificatie van bacteriën in geselecteerde histologische structuren of letsels in operatiestukken van Crohn patiënten.In het eerste deel van dit werk trachtten we te bepalen welke darmletsels bij Crohn patiënten het meest waarschijnlijk pathogene bacteriën bevatten. We onderzochten daarom of er een associatie bestaat tussen de histopathologische kenmerken van de ziekte en de aanwezigheid van Crohn-geassocieerde varianten van de CARD15 of TLR4 genen (Arg702Trp, Gly908Arg en Leu1007fsinsC voor CARD15 en Asp299Gly voor TLR4). De eiwitproducten van deze genen detecteren onder normale omstandigheden componenten van de bacteriële celwand respectievelijk binnen en buiten humane cellen. Na binding van het ligand wordt de nucleaire factor kappa B pathway geactiveerd. Deze is betrokken bij het tot stand komen van een inflammatoire respons. De Crohn-geassocieerde varianten leiden tot een gedeeltelijk of volledig verlies van deze respons op bacteriën, waardoor deze lokaal zouden kunnen prolifereren en letsels veroorzaken. In een eerste studie op 57 operatiestukken van Crohn patiënten waarvan het CARD15 genotype werd bepaald, konden we geen statistisch significant verband vinden tussen het optreden van bepaalde letsels en de aanwezigheid van CARD15 risico varianten. Er waren echter aanwijzingen dat epitheloïde granulomen meer frequent zouden kunnen zijn in patiënten die drager zijn van genetische CARD15 risicovarianten. Daarom werd een tweede studie uitgevoerd op een groep van 161 operatiestukken van CARD15- en TLR4-gegenotypeerde Crohn patiënten. We vonden hierbij geen significant verband tussen het genotype van de patiënten en de aanwezigheid van granulomen. We veronderstellen daarom dat deze letsels zich niet ontwikkelen bij alle Crohn patiënten met CARD15- of TLR4-risico varianten, maar enkel bij diegenen die in contact gekomen zijn met specifieke bacteriën.In het tweede deel van deze thesis trachtten we bacteriën op te sporen en te identificeren in een grote groep darmstructuren en Crohn letsels die mogelijks pathogene micro-organismen kunnen bevatten. We kozen voor een onderzoeksstrategie bestaande uit een combinatie van laser capture microdissectie en amplificatie van het bacteriële 16S rRNA gen door middel van de polymerase kettingreactie (PCR), gevolgd door het subkloneren en DNA sekwentiebepaling van de PCR producten. Onze experimenten zijn de eerste waarin deze techniek met succes wordt toegepast voor de inventarisatie van de darmflora in gemicrodisseceerde Crohn letsels. We ontwikkelden eerst een experimenteel protocol dat geschikt is voor de analyse van de bacteriële flora in gemicrodisseceerde weefselfragmenten. In een tweede studie hebben we dit protocol uitgetest op een set controlestalen (mucosale biopsies afgenomen van de dunne en de dikke darm onder diverse klinische omstandigheden). We konden hierbij het bestaan bevestigen van een karakteristieke verticale distributie van bacteriële taxa langsheen de maag-darmtractus. We hebben ook veranderingen in de samenstelling van de flora aangetoond bij verschillende acute inflammatoire aandoeningen. In een derde studie pasten we ons protocol toe op gemicrodisseceerde weefselstalen van Crohn patiënten en controles. Bacteriën aanwezig in deze stalen konden met succes opgespoord en geïdentificeerd worden. Crohn patiënten verschilden van controles door een hoger aantal mucosa-geassocieerde bacteriën (in het bijzonder Enterobacteriaceae). Het optreden van focale ontsteking en ulceratie bij Crohn kon niet toegeschreven worden aan een gelokaliseerde dysbiose. Bacteriële translocatie bij Crohn patiënten was een niet-selectief proces dat meer intensief werd bij beschadiging van het darmslijmvlies. DNA van Legionellaceae werd gedetecteerd in de myenterische plexus van Crohn patiënten met CARD15 risico varianten. In een vierde studie onderzochten we uitgebreid de bacteriële flora aanwezig in diverse Crohn letsels. Onze eerdere resultaten met betrekking tot dysbiose en bacteriële translocatie werden hierbij bevestigd. Geen enkele mogelijke verwekker van Crohn kon met zekerheid geïdentificeerd worden, al is Escherichia coli wel een goede kandidaat. De rol van Legionellaceae in de pathogenese van de ziekte van Crohn zou ook verder moeten uitgewerkt worden. Uit onze resultaten konden we ook afleiden dat granulomen bij Crohn waarschijnlijk een niet-specifieke reactie zijn op de aanwezigheid van verschillende soorten bacteriën of hun bestanddelen.Als besluit kunnen we stellen dat deze thesis nieuwe data aanbrengt over de betrokkenheid van bacteriën bij de pathogenese van de ziekte van Crohn. Hoewel geen enkele van de drie huidig gangbare hypothesen over dit onderwerp met zekerheid kon uitgesloten worden, suggereren onze resultaten toch dat een toegenomen bacteriële translocatie in belangrijke mate bijdraagt tot het ontstaan en het onderhouden van chronische inflammatie bij de ziekte van Crohn.