Author:

Abstract:

GATA1 deficiëntie is een X-gebonden hematopoietische aandoeninggekenmerkt door een variabele graad van anemie en macrothrombocytopeniemet potentieel lethale bloedingen. De ziekte wordt veroorzaakt door eenmutatie in het GATA1 gen dat codeert voor een transcriptiefactoressentieel in erythropoiese en megakaryocytaire differentiatie. In dezethesis werden twee nieuwe GATA1-gerelateerde aandoeningen bestudeerd:een myelodysplastisch fenotype met bloedplaatjesdysfunctie veroorzaaktdoor een clonale GATA1 mutatie, en refractaire thrombocytopeniegecombineerd met gastrointestinale angiomatosis op basis van eenanti-GATA1 auto-antistof.Dehuidige behandelingsopties voor GATA1 deficiëntie zijn erg beperkt.Daarom werd een lentivirale vector-gebaseerde ex vivo gentherapiebenadering bestudeerd voor een mogelijks definitieve genezing van dezebloedingsziekte. Genetisch gemodificeerde autologe HSCs werden gebruiktvoor in vivo fenotypischecorrectie in een GATA1 deficiënt muizenmodel. De nadruk werd gelegd ophet ontwikkelen van een megakaryocyt-specifieke SIN lentivirale vectorom transgene expressie specifiek te beperken tot de megakaryocyten enzo ongewenste effecten door expressie van het transgen in de anderebloedcellijnen te vermijden, en om het risico op insertionele activatievan naburige genen te minimalizeren. Efficiënte enmegakaryocyt-specifieke GFP expressie werd bereikt in murine en humanemegakaryocyten in vitro, ookin een GATA1 deficiënte genetische achtergrond. De megakaryocytairespecificiteit van de lentivirale vector constructen werd ookgedemonstreerd in vivo doorhet bekomen van circulerende GFP-positieve bloedplaatjes natransplantie van genetisch gemanipuleerde HSCs. Lange termijn GFPexpressie suggereerde genetische modificatie van ‘long-termrepopulating HSCs’ en dit werd inderdaad bevestigd in secundairetransplantaties. Fenotypische correctie van GATA1-/- muizen werdbekomen door wild type beenmergtransplantatie. Door het uitvoeren vanstaartbloedingen in chimerisme experimenten werd aangetoond dat eendonorpopulatie met 10% wild type cellen kan resulteren in eenfunctionele fenotypische correctie van GATA1 deficiëntie. Hetcorresponderende bloedplaatjesaantal geëxtrapoleerd naar patiënten isinderdaad voldoende ter preventie van klinische bloedingsproblemen.Deze bemoedigende resultaten leidden tot de uiteindelijke experimentenom fenotypische correctie te bekomen in GATA1-/- muizen doortransplantatie van autologe HSCs ex vivo getransduceerdmet GATA1-coderende lentivirale vectoren. De resultaten van dezeexperimenten waren echter minder vanzelfsprekend, meest waarschijnlijkdoor het lage aantal genetisch gemodificeerde cellen in dedonorpopulatie. Toevoeging van in vivoselectie van genetisch gemodificeerde HSCs door gebruik van hetchemoresistentie gen MGMT-P140K leidde tot veelbelovende resultaten ende bevestiging dat functionele correctie van thrombocytopenie mogelijkis na hematopoietische reconstitutie van GATA1-/- muizen met GATA1-/-HSCs die genetisch gecorrigeerd zijn door lentivirale vectortransductie. Dit beantwoordt aan het hoofddoel van deze studie door hetbevestigen van het proof of principle concept dat gentherapiehereditaire thrombocytopenie door GATA1 deficiëntie effectief kancorrigeren, maar een grotere studiegroep analoog behandelde muizen zalnodig zijn om deze initiële resultaten te bevestigen.