Author:

Abstract:

Caenorhabditis elegans is een kleine vrijlevende bacteriovore bode mnematode, die in het post-genomische tijdperk razendsnel uitgegro eid is tot een supermodel. Deze worm wordt niet alleen gebruikt voor de studie van parasitaire nematoden, maar vormt tevens een belangrijk model voor de studie van menselijke ziektegenen. In de moderne geneeskunde en bij pestbestrijding vormen G-proteine gekoppelde receptoren de belangri jkste groep van doelwitmoleculen voor zowel agro-chemische stoffen als t herapeutische geneesmiddelen. Het farmacologische belang van GPCRs en hu n liganden wordt nu uitgebuit om de potentiële doelwitmoleculen van de t oekomst te identificeren. Neuropeptiden en hun receptoren bekleden de ho ogste hiërarchische positie in de fysiologie van dieren en orchestreren diverse biologische processen en gedragingen, waaronder reproductie, met amorfose, suiker- en vetmetabolisme, de regulatie van lichaamspigmentati e, voedselopname, vertering, voortbeweging enz. Ondanks de vele inspanni ngen, die geleverd zijn na de vervollediging van het C. elegans ge noom in 1998, en de uitgesproken diversiteit aan potentiële signaalmolec ulen, is er maar zéér weinig geweten over de neuropeptiderge signaaltran sductiesystemen die aan de basis liggen van de complexe gedragingen van dit nematode supermodel. Het doel van deze studie richtte zich dan ook op de identificatie en ont wezing van enkele nieuwe neuropeptide receptor signaalsystemen en de ont rafeling van hun rol in het gedrag van C. elegans, en van nematode n in het algemeen. Eerst hebben we met behulp van een specifieke bio-informatica tool de po tentiële peptide bindende GPCRs in het C. elegans genoom geïdentif iceerd en geselecteerd. Het aansluitend gebruik van een gecombineerde om gekeerde farmacologie strategie resulteerde in de succesvolle ontwezing van zes GPCRs, waarvan er vijf gekoppeld konden worden aan een natuurlij k ligand behorende tot de NLP peptiden familie. Het gecombineerde gebruik van biochemische en peptidomics methoden heeft in deze studie o.a. geleid tot de biochemische isolatie, identificatie en karakterisatie van drie pigment dispersing factor -achtige neuropepti den (PDF-1a, b en PDF-2) en de ontwezing van drie overeenkomstige PDF re ceptoren (PDFR). Tot op heden werd dit PDF neuropeptide signaalsysteem e nkel aangetoond in enkele arthropoden als onderdeel van hun circadiane k lok. Bij nematoden werd nog geen enkele component van de circadiane klok ontmaskerd. Het nieuw ontdekte PDF signaalsysteem blijkt zeer goed geco nserveerd te zijn binnen de nematoden, waaronder ook vele parasitaire so orten. In vivo lokalisatie experimenten tonen aan dat veel van de cellen die PDF of hun receptoren tot expressie brengen, betrokken zijn b ij de integratie van omgevingssignalen en de regulatie van de voortbeweg ing. Aan de hand van functionele testen konden we achterhalen dat het PD F signaalsysteem het voortbewegingsgedrag beïnvloedt en meer specifiek d at PDF-1 mede verantwoordelijk is voor de regulatie van het circadiane a ctiviteitsritme van C. elegans. Mutanten zonder PDF-1 vertonen imm ers een in de tijd naar voor geschoven activiteitsritme (onder licht-don ker cyclus) en worden zelfs volledig aritmisch onder constante duisterni s. qRT-PCR analyses toonden aan dat de spiegels van de PDF transcripten hoger liggen gedurende de nacht en constant laag zijn tijdens de dag. Di t valt mogelijk te verklaren door het directe of indirecte effect van li cht gemedieerde belemmering van de PDF expressie. Onze resultaten geven aan dat de PDF peptiden waarschijnlijk een belangrijke rol spelen als “o utput” signaal in het mechanisme dat aan de basis ligt van de circadiane klok bij C. elegans. Het geheel van onze resultaten wijst er op d at het PDF neuropeptide signaalsysteem, dat het klokritme oplegt aan ged ragingen bij de fruitvlieg Drosophila, goed geconserveerd is geble ven binnen de invertebraten, niet alleen structureel maar ook functionee l. Het versterkt tevens de hypothese dat de rol van het PDF signaalsyste em in de circadiane klok van invertebraten functioneel verwant is met de rol van het VIP neuropeptide signaalsysteem in de klok van zoogdieren. Ondanks de vele inspanningen die volgden op de ontdekking van cholecysto kinine/gastrine immunoreactiviteit in nematoden 23 jaar geleden, is de i dentiteit van deze nematode CCK/gastrine-achtige peptiden steeds een raa dsel gebleven. Door C. elegans receptoren, waarvan voorspeld werd dat ze verwant zouden zijn met de zoogdier CCKR receptoren, als vislijn te gebruiken, zijn we er nu in geslaagd twee endogene CCK-achtige peptid en te identificeren en te koppelen aan deze receptoren. Deze peptiden wo rden gecodeerd door het precursor-proteïne NLP-12. Leden van de CCK/gast rine familie, waartoe ook de sulfakinines van arthropoden worden gereken d, en hun overeenkomstige receptoren spelen een belangrijke rol in de re gulatie van voedingsgedrag (verzadiging) en energie homeostase. Het nieu w ontdekte CCK/gastrine-achtig signaalsysteem blijkt sterk geconserveerd te zijn binnen de groep van nematoden, waaronder vele soorten parasiete n. Vanuit een evolutionair oogpunt bekeken, zouden deze nematode CCK-ach tige peptiden de tot nu toe oudst bekende leden vormen van de CCK/gastri ne familie. Een in vivo expressie analyse toonde aan dat deze nema tode CCK-achtige peptiden mogelijks gesecreteerd worden door in de zenuw ring gelegen vesikel-gevulde aanhangsels van het DVA neuron. Deze aanhan gsels vormen mogelijk het equivalent van de neurohemale organen van inse cten (~corpora cardiaca) en vertebraten (~hypofyse). De peptiden blijken in vivo ongesulfateerd voor te komen en reageren specifiek met ee n antilichaam gericht tegen het humaan CCK-8. Zowel de receptoren als hu n CCK-achtige liganden vertonen sterke gelijkenissen met hun vertebraat en arthropood tegenhangers. Tevens vervullen ze een functioneel gelijken de biologische rol met betrekking tot de secretie van verteringsenzymen en de opslag van vetten. Het geheel van onze resultaten geeft aan dat di t nieuwe geïdentificeerde neuropeptide signaalsysteem bij C. elegans< /> niet alleen het structureel maar tevens het functioneel homoloog vorm t van het CCK/gastrine signaalsysteem bij vertebraten en het sulfakinine signaalsysteem bij arthropoden. Onze maatschappij evolueert naar een wereldwijde ‘24/7’ economie en cult uur, met ploegenwerk en jetlag als standaard, en zwaarlijvigheid en zijn bijhorende ziekten die al snel de industriële epidemie van de 21e eeuw zullen worden. Het belang en potentieel van een betere kennis omtrent de ze twee neuropeptide signaalsystemen in een super modelorganisme zoals < I>C. elegans spreekt daarom voor zich.