Author:

Abstract:

Het is duidelijk dat de analytische ondersteuning van een geneesmiddel o nontbeerlijk is in tijden waar kwaliteit en veiligheid zo belangrijk zij n. De kwaliteit van een geneesmiddel, en dus ook de veiligheid ervan, is vooral gericht op de chemie en de veiligheidsaspecten van de aanwezige onzuiverheden en verwante verbindingen. Omdat de aanwezigheid van onzuiv erheden zo een significante invloed heeft, is de eerste taak in kwalitei tscontrole de scheiding van alle aktieve bestanddelen en onzuiverheden a anwezig in een grondstof of een afgewerkt product. Vloeistofchromatograf ie (LC) en capillaire elektroforese (CE), twee complementaire scheidings technieken, worden meestal gebruikt als eerste-lijnkeuze voor deze taak. Het doel van dit onderzoek was kwaliteitscontrole op bepaalde anti-infec tieuze middelen mogelijk te maken door de ontwikkeling van selectieve LC of CE scheidingsmethoden. Deze methoden moeten het mogelijk maken om de kwaliteit van de geselecteerde geneesmiddelen te garanderen doordat ze gehaltebepalingen en de bepaling van de chromatografische zuiverheid toe laten en de aanwezige aktieve bestanddelen en verwante verbindingen kunn en opvolgen en karakteriseren. De karakterisering van de ongekende besta nddelen vereiste wel massaspectrometrisch onderzoek. &n bsp; Vier geneesmiddelen werden onderzocht waarbij het nut van LC, CE en LC-M S als analytische techniek voor de kwaliteitscontrole van deze geneesmid delen aangetoond werd. Omdat we wilden illustreren dat de kwalitei t van een geneesmiddel gedurende zijn hele bestaan moet gegarandeerd wor den, hebben we zowel gekozen voor geneesmiddelen in ontwikkeling als voo r geneesmiddelen beschikbaar op de markt. Voor de geneesmiddelen in de o ntwikkelingsfase werkten we samen met Tibotec NV. Zij zijn gespecialisee rd in nieuwe anti-infectieuze geneesmiddelen en voorzagen ons van alle b eschikbare verwante verbindingen en van stalen van verschillende loten. Voor de kwaliteitsgarantie van geneesmiddelen die al langer op de markt zijn, kozen we ook voor anti-infectieuze middelen. We hebben ons hier na melijk op macrolide antibiotica gericht omdat ons laboratorium beschikte over veel stalen van verschillende loten en producenten en over v eel referentieprodukten, zowel van de hoofdbestanddelen als van de verwa nte verbindingen. Daarenboven zijn antibiotica fermentatieprodukten die veel onzuiverheden bevatten, wat het concept van zuiverheidscontrole zee r belangrijk maakt. Het eerste te onderzoeken geneesmiddel was een plantaardig anti-leish mania geneesmiddel in ontwikkeling, dat verkregen werd uit de bladere n van een Vietnamese plant Maesa balansae. Zes triterpeen sap onines waren verantwoordelijk voor de aktiviteit, waaronder saponine 3 e n 4 het meest aktief waren. Omdat het niet mogelijk was om te werken met zuivere saponine 3 of 4, werd er van de saponines een gestandaardiseerd mengsel gemaakt. Dit gestandaardiseerd mengsel kan slechts als een plan taardig geneesmiddel beschouwd worden indien de consistentie van de vers chillende loten gegarandeerd wordt of m.a.w indien de verhouding tussen de verschillende saponines constant is. Dit kan aangetoond worden door g ebruik te maken van analytische scheidingsmethoden zoals LC. Daarom werd er een gradiënt LC methode ontwikkeld waarmee de zuiverheid en de samen stelling van de verschillende extracten bepaald werd. De scheiding van d eze saponines was echter niet gemakkelijk te realizeren omdat saponine 1 en 3 en saponine 2 en 4 isomeren zijn. Omdat er later in de ontwikkelin g meer opgezuiverde stalen werden gebruikt die hoofdzakelijk de twee mee st actieve saponines bevatten, werd de gradiënt methode omgevormd tot ee n isocratische methode. Deze isocratische methode werd geoptimaliseerd e n gevalideerd en vertoonde een goede selectiviteit, lineariteit en gevoe ligheid. Het tweede geneesmiddel dat bestudeerd werd was TMC114, een nieuwe, pote ntiële humaan immunodeficiëntie virus proteaseremmer waarvan er in totaa l 16 isomeren bestaan. Omdat het wenselijk was om een chirale methode vo orhanden te hebben, werd de methode-ontwikkeling bij voorkeur opgestart met CE. Verschillende CE modes werden uitgeprobeerd maar alleen MEEKC bl eek het vermogen te hebben om isomeren van TMC114 te scheiden. Door de&n bsp; verschillende parameters aan te passen slaagden we erin om de diastereoisomeren te scheiden. Acetonitril en een achiraal diaza crown e ther-derivaat werden gebruikt als additief. Er werd echter geen scheidin g bekomen van de enantiomeren. Natuurlijk rijst de vraag of CE wel de ju iste keuze was voor deze taak. Misschien was het wel mogelijk om een chi rale scheiding te bekomen tussen alle isomeren als we voor LC gekozen ha dden. Alhoewel LC herhaalbare en gevoelige resultaten oplevert, heeft he t ook één groot nadeel namelijk dat het gebruik van chirale kolomme n en/of selectoren zeer duur is. Maar zoals elke techniek zijn voor- en nadelen heeft, geldt dit ook voor LC. Het derde geneesmiddel dat onderzocht werd was het semi-synthetische mac rolide clarithromycine. Clarithromycine bleek verschillende ongeïdentifi ceerde onzuiverheden te bevatten. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) werd gebruikt om deze onzuiverheden te bestudere n. LC-MS onderzoek vereiste echter aanpassing van de bestaande conventio nele LC methode die gebruik maakte van een niet-vluchtige fosfaatbuffer. Clarithromycine werd gescheiden van de bekende onzuiverheden en van vij f onbekende componenten met een XTerra C18, 250 mm x 2.1 mm I.D., 5 µm kolom en gebruik makende van een mobiele fase samengesteld uit 0.1 M ammoniumwaterstofcarbonaat pH 6.8 - acetonitril - water (6:40:54, v/v). De identiteit van één onbekende component kon bepaald worden als 1 3-desethyl-13-propyl clarithromycine met ESI tandem MS door gebruik te m aken van de MS/MS en MSn spectra van gekende clarithromycine analogen wa arvan een referentiestof beschikbaar was. Twee andere onbekenden konden op gelijkaardige wijze gekarakteriseerd worden als een isomeer van (E )-Me-oxime en een isomeer van N-oxide, respectievelijk, te rwijl voor de karakterisering van de resterende onbekenden verder onderz oek nodig is. Het is duidelijk dat de LCQ “ion trap” massaspectrometer n aast zijn verdiensten ook tekortkomingen kent. De MSn optie van de “ion trap” maakt het mogelijk een rijkdom aan structuurinformatie te be komen die niet te verkrijgen is met MS/MS experimenten en maakt dit toes tel daarom uitermate geschikt voor de karakterisering van onzuiverheden, zonder tijdrovende isolatie- en zuiveringsprocedures. Daarentegen moet men rekening houden met de “low mass cut-off value” en kan het toestel g een onderscheid maken tussen signalen van bvb. stereoisomeren, maar dat laatste kan geen enkele massaspectrometer. Verdere karakterizering van d e onbekende onzuiverheden vereist andere technieken zoals accurate massa MS en/of MS gevoeliger in het lage massa gebied. LC-NMR behoort ook tot de mogelijkheden. Dit vereist meestal wel een grotere hoeveelheid monst er. Het laatst onderzochte geneesmiddel was het macrolide erythromycine. Voo rheen werden er in ons laboratorium twee LC methoden ontwikkeld voor het onderzoek van commerciële erythromycine stalen. Eén van deze methoden w erd omgevormd tot een vluchtige methode die bruikbaar was voor de karakt erisering van nieuwe erythromycine onzuiverheden. Maar tot hiertoe werde n de vluchtige en niet-vluchtige methoden nog niet gecorreleerd met elka ar waardoor de nieuwe erythromycine onzuiverheden nog niet toegewezen ku nnen worden met de niet-vluchtige methoden. Vandaar dat ‘peak tracking’ ons doel was. We trachtten dit te doen door MS analyses uit te voeren me t de niet-vluchtige methoden zelf. Dit bracht wel een aantal moeilijkhed en met zich mee. Afzetting van de zouten op de ionisatiebron/interface l eidde tot een enorme prestatie afname en tot catastrofale faling van de MS. Het gebruik van een OSA-schild, ter bescherming van het MS instrumen t, kon geen verbetering van de robuustheid teweeg brengen. Verder onderz oek is nodig, waarbij liefst gebruik gemaakt wordt van een andere strate gie zoals de toepassing van schakelsystemen. Met dit werk werd het nut aangetoond van zowel LC als CE als selectieve scheidingstechniek voor het opstellen van onzuiverheidsprofielen en voor de kwaliteitscontrole in het algemeen. Ondanks de complexiteit van een kwaliteitscontrole is de keuze van de geschikte techniek(en) een stap in de juiste richting om problemen in de kwaliteitscontrole aan te pakken. Alhoewel LC de meest gebruikte techniek is in de farmaceutische industr ie en de eerste-lijn keuze is voor routine analyse, terwijl CE meer aang eraden wordt bij chirale analyse, kan er toch niet zomaar bepaald worden welke techniek nu de meest geschikte is voor een welbepaalde toepassing . Elke techniek kent immers zijn voordelen en nadelen. Daarom is het van belang om zoveel mogelijk te weten te komen over de te analyseren monst ers en de mogelijke technieken vooraleer een analyse te starten. De keuz e van de meest geschikte techniek moet doordacht en doorgrond zijn omdat elke verandering hierin verklaard moet kunnen worden. De koppeling van de scheidingstechnieken aan massaspectrometrie biedt de mogelijkheid om structurele informatie te verkrijgen van een bepaalde component. Omdat o ns laboratorium beschikt over een gekoppeld LC-MS systeem, hebben we dit gebruikt voor de karakterisering van onzuiverheden. Interpretatie van d e MS gegevens van onzuiverheden was gebaseerd op een grondige studie van het fragmentatiegedrag van gekende componenten. Alhoewel LC-MS een tech niek is die zeer geschikt is voor de karakterisering van onzuiverheden e n dus voor het opstellen van een onzuiverheidsprofiel, heeft ze naast ve rdiensten toch ook tekortkomingen. Dit is natuurlijk het geval voo r elke analytische techniek.