ITEM METADATA RECORD
Title: Development of a DNA Array for Multiplex Detection and Quantification of Plant Pathogens
Other Titles: Ontwikkeling van een DNA array voor multiplex detectie en kwantificatie van plantpathogenen
Authors: Lievens, Bart
Issue Date: 5-Jul-2006
Abstract: Accurate detectie en identificatie van plantpathogenen zijn onontbeerlijk voor de diagnose van plantenziekten dat de basis vormt van een veilige en duurzame gewasbescherming. De specifieke tekortkomingen van de klassieke kweek- en morfologie-gebaseerde identificatiemethoden hebben geleid tot de ontwikkeling van moleculaire benaderingen die geen kweek van de te identificeren micro-organismen vereisen. In de laatste decennia zijn verschillende serologische en nucleïnezuurgebaseerde technieken ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van plantpathogenen (Hoofdstuk 1). Bepaalde van deze technieken laten bovendien een betrouwbare kwantificatie van de doelwitpathogeen toe en verschaffen aldus de vereiste informatie voor het inschatten van de risico’s wat betreft ziekteontwikkeling, inoculumverspreiding en economische verliezen. De belangrijkste uitdaging bij de aanvang van het onderzoek beschreven in deze thesis bestond erin een multiplex test te ontwikkelen die geschikt is voor het gelijktijdig opsporen en kwantificeren van een breed gamma aan plantpathogenen.In deze thesis wordt de ontwikkeling van een DNA “macroarray” beschreven die aan deze vereisten voldoet. In eerste instantie werden de algemene voorwaarden bepaald voor het ontwikkelen van selectieve detectoroligonucleotiden (Hoofdstuk 2). De bruikbaarheid van DNA “arrays” om “single nucleotide polymorphisms” te detecteren is aangetoond door specifieke criteria zoals de positie van de “mismatch”, de sequentie van het oligonucleotide en de lengte en hoeveelheid van de gemerkte amplicons in acht te nemen. Op basis van deze criteria werd vervolgens een DNA “macroarray” ontwikkeld die getest is voor een snelle en efficiënte detectie en identificatie van een beperkte set schimmelpathogenen in biologisch complexe stalen zoals plant- en grondstalen (Hoofdstuk 3). Als “proof-of-principle” werd de “macroarray” ontwikkeld voor een aantal belangrijke ziekteverwekkers van tomaat dat wereldwijd één van de economisch belangrijkste vruchtgewassen is. Meer bepaald werd gekozen voor de vaatbundelpathogenen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Verticillium albo-atrum en V. dahliae. In Hoofdstuk 5 werd deze “array” verder geoptimaliseerd om een accurate kwantificatie van de pathogenen te bewerkstelligen over tenminste drie grootte-ordes die praktijkrelevant zijn. Een sterke correlatie werd vastgesteld tussen de hybridisatiesignalen en de pathogeenconcentraties, zowel voor standaard DNA (al dan niet in aanwezigheid van niet-doelwit DNA) als voor besmette stalen. Wanneer specifieke criteria zoals de hoeveelheid gebonden oligonucleotiden en bepaalde controles voor het amplificatieproces in acht werden genomen, kon een accurate kwantificatie bewerkstelligd worden voor praktijkrelevante pathogeenconcentraties. Gezien kwantificatie op basis van kweekmethoden als relatief onnauwkeurig of zelfs onbetrouwbaar wordt beschouwd, werd real-time PCR, een reeds gevestigde techniek om DNA te kwantificeren (Hoofdstuk 4), als referentietechniek gebruikt ter validatie van de kwantificering met behulp van de DNA “array”. Het feit dat beide kwantificatiemethoden sterk gecorreleerd waren illustreert de betrouwbaarheid en robuustheid van het kwantitatieve karakter van DNA “macroarrays”. In het kader van een geïntegreerde gewasbeschermingstrategie werd tenslotte een kwantitatieve “macroarray” ontwikkeld om simultaan zowel pathogenen als biocontrole agentia te detecteren, alsook om hun interacties te bestuderen en hun aanwezigheid te koppelen aan ziekteontwikkeling en symptoomexpressie. Doordat momenteel geen gestandaardiseerde biotoets beschreven is voor tomaat, werd de reeds uitvoerig bestudeerde interactie tussen het biocontrole agenTrichoderma hamatum isolaat 382 en de pathogeen Rhizoctonia solani aangewend in een standaard biotoets van R. solani, de veroorzaker van omvalziekte, op radijs (Hoofdstuk 6). Uit deze studie kan geconcludeerd worden dat DNA “macroarrays” met succes kunnen gebruikt worden voor het gelijktijdig detecteren en kwantificeren van verschillende plantpathogenen in biologisch complexe stalen. Naast zijn toepassingsmogelijkheden voor het routinematig detecteren van plantpathogenen, heeft deze techniek bovendien het potentieel om ingezet te worden in diverse ecologische en epidemiologische studies.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Centre of Microbial and Plant Genetics
Microbial and Molecular Systems - miscellaneous
Bioengineering Technology TC, Technology Campus De Nayer Sint-Katelijne-Waver
Technologiecluster Bioengineering Technologie

Files in This Item:
File Description Status SizeFormat
Lievens.pdf Published 1260KbAdobe PDFView/Open

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.