ITEM METADATA RECORD
Title: Looking for proteins modulating Beta-secretase actvity
Other Titles: Zoektocht naar proteïnen die de activiteit van beta-secretase beïnvloeden
Authors: Marjaux, Els; M0331450
Issue Date: 14-Jan-2009
Abstract: Zoektocht naar proteïnen die de activiteit van b-secretase beïnvloeden. Bestaat er een uitdrukking die meer van toepassing is op de ziekte van Alzheimer (AD) dan het Romeinse gezegde “Ex minima magnus scintilla nascitur ignis” (een nietige vonk kan de oorzaak zijn van een gigantische brand)? Immers, het kleine amyloïde b (Ab) peptide, een peptide van zo’n 40 à 42 aminozuren dat aan de basis ligt van AD, is in staat om een complex pathologisch proces in de hersenen in gang te zetten dat uiteindelijk leidt tot amyloïde afzettingen, neurofibrillaire kluwens, een daling in het aantal synapsen en neuronale celdood. Ab ontstaat door proteolyse van het type I transmembranair voorlopereiwit, het Amyloïde Precursor Proteïne (APP), door de opeenvolgende werking van twee verschillende enzymen, namelijk b-secretase –ook b-site APP Cleaving Enzyme 1 (BACE1) genaamd– en g-secretase.Tot op heden beperkt de behandeling van de ziekte van Alzheimer zich enkel tot symptoombestrijding en is er nog geen effectief geneesmiddel voorhanden. Er worden verschillende strategieën gevolgd in de ontwikkeling van AD therapieën, maar een van de meest attractieve is het verhinderen van Ab productie door in te grijpen op de APP-klievende enzymen. De zoektocht naar potente inhibitoren van BACE1 en g-secretase is volop aan de gang. In dit werk onderzochten we 2 strategieën om de activiteit van BACE1, hetzij op een indirecte, hetzij op een directe manier te inhiberen.In een eerste deel van de thesis wordt gefocusseerd op het cytoplasmatisch domein van BACE1. Dit domein is betrokken in proteïne-proteïne-interacties die noodzakelijk zijn voor een correcte subcellulaire lokalisatie. Aangezien we konden aantonen dat verstoring van de subcellulaire lokalisatie van BACE1 in neuronen een nefaste impact heeft op de klieving van APP, kunnen proteïnen die betrokken zijn in lokalisatie van BACE1 eveneens van belang zijn om een optimale enzymatische activiteit te bekomen. Zulke BACE1-bindingspartners zouden nieuwe therapeutische doelwitten kunnen zijn.Met behulp van een gist dubbelhybridenscreening werden 20 kandidaat bindingspartners van het membraananker van BACE1 geïdentificeerd. Het merendeel van deze eiwitten werd slechts één maal opgepikt. Opmerkelijk was dat FKBP8 twintig keer werd teruggevonden in de screening en daarmee 38 percent van het totaal aantal opgepikte proteïnes vertegenwoordigde. Dit eiwit werd geselecteerd voor verdere karakterisatie. Er werd aangetoond dat FKBP8 een transmembranair eiwit is met een wijdverbreide weefselexpressie. De interactie van BACE1 met FKBP8 werd bevestigd in een in vitro GST-coprecipitatie. Ondanks het feit dat deze interactie niet kon worden bevestigd in cellen met behulp van coimmunoprecipitatie werd toch nagegaan of FKBP8 een rol zou kunnen spelen in APP proteolyse. Zowel bij overexpressie van FKBP8 als bij een gedaalde expressie van endogeen FKBP8, bekomen met behulp van transfectie met FKBP8-specifieke, synthetische siRNA-moleculen, kon geen effect op APP klieving worden vastgesteld in N2A en HEK293 cellen. Als alternatieve strategie om eiwitten op te sporen die de activiteit van BACE1 kunnen moduleren werd gestart met de aanmaak van BACE1-specifieke lama- en dromedarisantilichamen die dankzij hun opmerkelijke structurele opbouw in de actieve site van enzymen kunnen binden en op die manier enzymes kunnen inhiberen. Na immunisatie van een dromedaris en een lama werden 24 verschillende antilichamen geïsoleerd. Twee antilichamen, Nb_B2 en Nb_B26, bleken in staat om in een in vitro test b-secretase activiteit te inhiberen en zes antilichamen konden BACE1 activiteit stimuleren. Verrassend genoeg kon de sterkste in vitro stimulator Nb_B9 –en niet de twee in vitro inhibitoren Nb_B2 en Nb_B26– na overexpressie in cellen APP proteolyse inhiberen. Vooraleer meer tijd te investeren in Nb_B9 is het aan te bevelen uit te zoeken waarom dit antilichaam in de ene conditie fungeert als BACE1 inhibitor, terwijl het in een andere conditie daarentegen b-secretase activiteit kan stimuleren.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Molecular Genetics Section (-)
Department of Human Genetics - miscellaneous

Files in This Item:
File Description Status SizeFormat
Doctoral Thesis Els Marjaux.pdf Published 2092KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.