ITEM METADATA RECORD
Title: Chemical synthesis of N-acyl homoserine lactone analogues and brominated furanones, and their biological activities with Salmonella enterica serovar Typhimurium and Vibrio spp.
Other Titles: Chemische synthese van N-acyl-homoserinelacton-analogen en gebromineerde furanonen, en hun biologische activiteit t.o.v. Salmonella enterica serovar Typhimurium en Vibrio spp.
Authors: Janssens, Joost; M9917112;
Issue Date: 3-Oct-2008
Abstract: Salmonella enterica is een Gram-negatieve ziekteverwekker en één van de voornaamste oorzaken van bacteriële voedselvergiftigingen. Gezien de sterke toename in het aantal Salmonella-stammen die resistent zijn tegen meerdere antibiotica en aangezien Salmonella biofilmen kan vormen op een brede waaier van vaste oppervlakken, waardoor de bacterie beter kan overleven buiten de gastheer, is het van groot belang om nieuwe therapeutica tegen deze pathogeen te ontwikkelen.Quorum sensing (QS) is een bacterieel communicatiesysteem dat gebruik maakt van kleine signaalmoleculen en waarvan reeds bij verschillende bacteriële pathogenen werd aangetoond dat het betrokken is in de regulatie van biofilmvorming en de aanmaak van virulentiefactoren. Daarom wordt QS bestudeerd als een nieuw doelwit voor de ontwikkeling van innovatieve antibacteriële therapieën. Het gebruik van kleine scheikundige moleculen voor interferentie met de receptoren voor de bacteriële signaalmoleculen is één van de mogelijke strategieën om het QS communicatiesysteem te verstoren. Twee klassen van moleculen waarvoor reeds werd aangetoond dat ze kunnen interfereren met zulke receptoren zijn de N-acyl-homoserinelacton (AHL)-analogen, die een gelijkaardige structuur hebben als de natuurlijke QS-signaalmoleculen die gebruikt worden door vele Gram-negatieve bacteriën, en de gebromeerde furanonen. Van de gebromeerde furanonen werd ook reeds aangetoond dat ze kunnen interfereren met de biofilmvorming door verschillende bacteriesoorten.In dit doctoraatswerk werd een multidisciplinaire benadering gebruikt in een poging om moleculen te identificeren die de QS-systemen van Salmonella enterica serovar Typhimurium kunnen activeren of inhiberen, alsook om componenten te identificeren die de vorming van biofilmen door Salmonella kunnen verhinderen.Eerst werden kleine bibliotheken van AHL-analogen en gebromeerde furanonen aangemaakt via chemische synthese. Eveneens werd er een chemische syntheseweg ontworpen die gebruikt kan worden voor de synthese van een nieuwe klasse van afgeleiden van de gebromeerde furanonen. Vervolgens werden de gesynthetiseerde moleculen getest op hun biologische activiteit t.o.v. S. Typhimurium.De activiteit van de AHL-analogen werd getest op één van de QS-systemen van Salmonella, met name de AHL-receptor SdiA, en er werden twee interessante klassen van AHL-analogen geïdentificeerd. De N-(3-oxo-acyl)-trans-2-aminocyclohexanolen zijn sterke activatoren van SdiA die stabiel zijn in alkalische condities en ongevoelig voor lactonase enzymen, terwijl sommige N-(3-oxo-acyl)-homocysteine thiolactonen geïdentificeerd werden als de sterkst gekende activatoren van SdiA. Deze laatsten zijn dan ook erkend als zogenaamde ‘super-activatoren’ van SdiA. Verschillende gebromeerde furanonen werden geïdentificeerd als inhibitoren van biofilm-vorming door Salmonella bij concentraties die geen effect hadden op de groei van planktonische cellen. Voorbehandeling met deze gebromeerde furanonen maakte de Salmonella-biofilmen gevoeliger voor behandeling met verschillende antibiotica. Vervolgens werd het werkingsmechanisme van deze furanonen bestudeerd. Terwijl er werd aangetoond dat deze moleculen niet interfereren met de huidig gekende QS-systemen van Salmonella, toonden een microrooster-experiment en experimenten ter bevestiging van dit hoge-doorvoerexperiment aan dat de gebromeerde furanonen de flagellaire biosynthese inhiberen bij Salmonella. Aangezien voor een mutant die geen flagellen kan vormen, werd aangetoond dat deze ook geen biofilmen vormde, is het mogelijk dat de gebromeerde furanonen de biofilm-vorming door Salmonella inhiberen via interferentie met de flagellaire biosynthese.Aangezien er reeds werd aangetoond dat enkele gebromeerde furanonen QS, bioluminescentie en virulentie inhiberen bij de mariene bacterie Vibrio harveyi, werd de activiteit van de furanonenbibliotheek ook in vitro getest t.o.v. bioluminescentie door deze pathogeen. Het meest actieve molecule, dat in vitro minder toxisch was voor V. harveyi dan de furanonen die in het verleden gebruikt werden, werd geselecteerd voor een in vivo-virulentie-experiment met het zoutkreeftje Artemia franciscana. Dit molecule bleek helaas toxisch voor Artemia. Samenvattend heeft dit doctoraal werk kennis opgeleverd over de synthese van AHL’en en nieuwe strategieën voor de synthese van gebromeerde furanonen, alsook meer inzicht in de specificiteit van de SdiA-ligand-interactie. Deze kennis zou in de toekomst gebruikt kunnen worden bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutica die gebaseerd zijn op interferentie met QS. De voornaamste verwezenlijking van dit werk is dat aangetoond werd dat bepaalde gebromeerde furanonen potentieel hebben in het voorkomen van biofilmvorming door S. Typhimurium.
Table of Contents: TABLE OF CONTENTS i

LIST OF ABBREVIATIONS v

SAMENVATTING vii

SUMMARY ix

CHAPTER 1 SCOPE OF THE THESIS 1
1.1 Salmonella and food-borne disease 1
1.2 Biofilms 2
1.3 Quorum Sensing 4
1.4 Overview of the thesis 7

CHAPTER 2 SMALL MOLECULES FOR INTERFERENCE WITH CELL-CELL COMMUNICATION SYSTEMS IN GRAM-NEGATIVE BACTERIA 11
2.1 Introduction 12
2.2 Survey of QSI bioassays 15
2.3 New quorum sensing inhibitors 16
2.3.1 Natural sources 16
2.3.2 Synthetic sources 20
2.4 Mechanism of action 30
2.5 Conclusions and perspectives 33

CHAPTER 3 CHEMICAL SYNTHESIS OF N-ACYL HOMOSERINE LACTONES AND BROMINATED FURANONES 37
3.1 Introduction 38
3.2 Materials and methods 39
3.2.1 Chemical products and techniques 39
3.2.2 Synthesis of N-(3-oxoalkanoyl)-DL-homoserine lactones 40
3.2.3 Synthesis of N-(3-hydroxyalkanoyl)-DL-homoserine lactones 41
3.2.4 Synthesis of brominated 3-alkyl-5-methylene-2(5H)-furanones 41
3.2.5 Synthesis of other furanones 43
3.3 Results 48
3.3.1 Synthesis of N-acyl homoserine lactones and analogues 48
3.3.2 Synthesis of brominated furanones via known synthesis methods 51
3.3.3 Development of a novel synthesis route for brominated furanones 55
3.4 Discussion 60

CHAPTER 4 SYNTHESIS OF N-ACYL HOMOSERINE LACTONE ANALOGUES REVEALS STRONG ACTIVATORS OF SDIA, THE SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM LUXR HOMOLOGUE 63
4.1 Introduction 64
4.2 Materials and methods 66
4.2.1 Bacterial strains, plasmids and media 66
4.2.2 Synthesis of AHLs and analogues 66
4.2.3 Dose-response experiments 67
4.2.4 Competition assays 68
4.2.5 Thin-layer chromatography 68
4.2.6 Lactonase experiments 69
4.2.7 pH stability experiments 69
4.2.8 Preparation of cell lysates and extraction of intracellular compounds 70
4.2.9 Reproducibility of bioassays 70
4.3 Results 71
4.3.1 Synthesis of AHLs and analogues 71
4.3.2 Inducing activity with LuxR and SdiA 71
4.3.3 N-(3-oxo-acyl)-homocysteine thiolactones are stronger activators of SdiA than N-(3-oxo-acyl)-homoserine lactones 74
4.3.4 N-(3-oxo-acyl)-2-aminocyclohexanols are less sensitive to lactonase and alkaline pH conditions than 3O-AHLs and 3O-AHTLs 76
4.3.5 Inhibitor activity with LuxR and SdiA 78
4.3.6 SdiA does not retain detectable amounts of the activating compounds after extensive washing 80
4.4 Discussion 80

CHAPTER 5 BROMINATED FURANONES INHIBIT BIOFILM FORMATION BY SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM, INDEPENDENT OF QUORUM SENSING 85
5.1 Introduction 86
5.2 Materials and methods 88
5.2.1 Bacterial strains, plasmids and media 88
5.2.2 Synthesis of chemical compounds 88
5.2.3 Plasmid construction 90
5.2.4 Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) 90
5.2.5 QS reporter experiments 91
5.2.6 Fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis 91
5.2.7 Peg assay for biofilm formation 92
5.2.8 Determination of the number of viable biofilm cells 92
5.2.9 Epifluorescence microscopy 93
5.2.10 Transcriptome microarray analysis 94
5.2.11 Staining of flagella 95
5.2.12 Swimming assay 95
5.2.13 Reproducibility of bioassays 95
5.3 Results 96
5.3.1 Synthesis and MIC determination of brominated furanones 96
5.3.2 Brominated furanones interfere with luminescence reporter systems and do not inhibit QS-controlled gene expression in Salmonella 96
5.3.3 Brominated furanones inhibit Salmonella biofilm formation 103
5.3.4 Effect of the combination of furanones with antibiotics on biofilm formation 107
5.3.5 Identification of genes influenced by FurC2-di(1) 108
5.3.6 FurC2-di(1) affects flagellar biosynthesis 116
5.4 Discussion 119

CHAPTER 6 BROMINATED FURANONES INHIBIT QUORUM SENSING-REGULATED BIOLUMINESCENCE IN VIBRIO HARVEYI 125
6.1 Introduction 126
6.2 Materials and methods 128
6.2.1 Bacterial strains and growth conditions 128
6.2.2 Synthesis of furanones 129
6.2.3 Luminescence experiments 129
6.2.4 Axenic hatching of Artemia franciscana 129
6.2.5 Challenge test 130
6.3 Results 130
6.3.1 Activity of furanones on bioluminescence by Vibrio harveyi BB120 130
6.3.2 FurC8-di is the strongest inhibitor of luminescence in Vibrio harveyi BB120 131
6.3.3 Effect of FurC8-di on V. harveyi and V. campbelli virulence in Artemia franciscana 133
6.4 Discussion 134

CHAPTER 7 GENERAL CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES 139

APPENDIX 1 NMR AND GC-MS DATA 147
A1.1 N-acyl homoserine lactones and analogues 147
A1.2 Brominated furanones 151
A1.3 Other furanones 153

APPENDIX 2 INFLUENCE OF SDIA ON BIOFILM FORMATION BY SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM 155
A2.1 Introduction 155
A2.2 Materials and methods 156
A2.2.1 Bacterial strains, plasmids and media 156
A2.2.2 Synthesis of chemical compounds 156
A2.2.3 Plasmid construction 156
A2.2.4 QS reporter experiments 158
A2.2.5 Peg assay for biofilm formation 158
A2.2.6 Epifluorescence microscopy 158
A2.3 Results and discussion 158
A2.4 Conclusions 163

APPENDIX 3 INFLUENCE OF MOLECULES, OTHER THAN FURANONES, ON BIOFILM FORMATION BY SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM 165
A3.1 Introduction 165
A3.2 Materials and methods 165
A3.3 Results and discussion 166

APPENDIX 4 INHIBITORY EFFECTS OF FURC2-DI(1) AND FURC8-DI ON EUKARYOTIC CELL LINES 169
A4.1 Results and discussion 169

REFERENCES 171

LIST OF PUBLICATIONS 191
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Centre of Microbial and Plant Genetics
Centre for Surface Chemistry and Catalysis

Files in This Item:
File Description Status SizeFormat
Joost Janssens_821_oktober 2008.pdf Published 3373KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.