ITEM METADATA RECORD
Title: The role of AMP-activated Protein Kinase (AMPK) in Neuronal Maintenance and Survival - Molecular-genetic analysis of beta-AMPK in D. melanogaster
Other Titles: De rol van AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK)in onderhoud en survival van het zenuwstelsel. Moleculair-genetische studie van beta-AMPK in D. melanogaster
Authors: Spasic, Milos
Issue Date: 17-Dec-2008
Abstract: Energieflux is een essentiële eigenschap van alle levende cellen. Alle eukaryote cellen hebben éénzelfde mechanisme ontwikkeld, om de cellulaire energiereserves te controleren en het energieverbruik te reguleren, waarin AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) de hoofdrol speelt. AMPK (of SNF1 in gist en planten) is een structureel en functioneel geconserveerd ser/thr kinase dat bestaat uit een catalytische α-subunit en regulatorische ß en γ-subunits. AMPK wordt geactiveerd door energietekort, dat weerspiegeld wordt door een toegenomen AMP:ATP verhouding, en reageert hierop door anabole processen te inhiberen en catabole processen te stimuleren, waardoor de energiebalans weer in evenwicht wordt gebracht.Neuronen zijn metabool zeer actieve cellen, met een zeer beperkte mogelijkheid voor energieopslag, wat hen zeer vatbaar maakt voor schommelingen in de energiereserves. Hierdoor is AMPK van onmiskenbaar belang voor de overleving van neuronen. Desondanks is AMPK pas recent op de voorgrond gekomen en de zeer beperkte hoeveelheid beschikbare data voorafgaand aan ons onderzoek was in hoofdzaak gebaseerd op in vitro data gebruikmakend van farmacologische of metabole stress modellen. In onze studie werd de rol van AMPK bij ontwikkeling, onderhoud en overleving van neuronen onderzocht, gebruik makend van het visueel systeem van Drosophila melanogaster als model.Gebruik makend van twee onafhankelijk gegenereerde mutante allelen van de -subunit van AMPK (alicorn, (alc)), toonden we aan dat ß-AMPK een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van het organisme maar niet bij de neuronale ontwikkeling. Verder toonden we aan dat hoewel ß-AMPK van belang is voor de apico-basale celpolariteit in epitheliale cellen het niet vereist is voor de correcte ontwikkeling van fotoreceptorneuronen. Hoewel dezelfde polariteitsdeterminanten op beide plaatsen tussenkomen, wijst dit op een weefselspecifieke rol voor AMPK. Bijkomend kon worden aangetoond dat AMPK een positieve invloed heeft op de overleving van de cel, want deletie van alc uit het visueel systeem en de hersenen leidt, naast gedrags- en neurofysiologische problemen, tot vroegtijdige en progressieve neurodegeneratie. Verder kon in deze studie ook worden aangetoond dat het degeneratiemechanisme niet apoptotisch en activiteitsafhankelijk is. Dit laatste kon worden aangetoond omdat de degeneratie kon worden tegengegaan door de fotoreceptoractiviteit te blokkeren. Daarenboven konden cellen in gevorderde staat van autofagie worden aangetroffen in degenererende retinas en degeneratie kon significant worden onderdrukt door autofagie te onderdrukken.We kunnen dus besluiten dat, hoewel AMPK niet essentieel is voor neuronale ontwikkeling, het van onmiskenbaar belang is voor neuronale homeostase en overleving. Deletie van AMPK leidt tot activiteitsafhankelijke neurodegeneratieve veranderingen en leidt uiteindelijk tot celdood door autofagie. Deze studie beklemtoont het belang van AMPK als respons op energetische stress en kan uiteindelijk de aanzet geven tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën ter behandeling van neuronale letstels en ziektes.
Table of Contents: List of commonly used abbreviations .................................................................... xi
List of gene symbols .................................................................................................. xiii
SUMMARY ........................................................................................................................ xv
SAMENVATTING ......................................................................................................... xvii
I. INTRODUCTION ..................................................................................................... 1
1.1 AMP-activated protein kinase (AMPK) as a guardian of cellular energy .... 1
1.1.1 Structure and regulation of AMPK ..................................................... 1
1.1.2 Activating AMPK................................................................................. 3
1.1.3 Downstream effectors ....................................................................... 4
1.1.4 AMPK in apico-basal polarity of epithelial tissues ............................. 7
1.1.5 What is downstream of AMPK in polarity determination? ................ 8
1.1.6 Regulation of TOR activity and autophagy by AMPK ......................... 9
1.2 Cell death – role of autophagy and apoptosis .......................................... 11
1.2.1 Autophagy as a double-edged sword .............................................. 11
1.2.2 Apoptotic cell death ......................................................................... 13
1.3 The Drosophila melanogaster eye as a model .......................................... 13
1.3.1 Phototransduction in Drosophila melanogaster .............................. 16
1.3.2 Development of the Drosophila retina and role of
apico-basal cell polarity ................................................................... 18
II. RATIONALE .......................................................................................................... 21
2.1 AMPK in neuronal metabolism and survival ............................................. 21
2.1.1 Is AMPK neuroprotective? ............................................................... 22
2.1.2 AMPK and neuronal cell death ........................................................ 23
III. OBJECTIVES ..................................................................................................... 25
3.1 Experimental approach ............................................................................. 25
IV. METHODOLOGY ............................................................................................. 27
4.1 Drosophila strains ..................................................................................... 27
4.2 The Gal4-UAS system ................................................................................ 27
4.3 Clonal analysis........................................................................................... 28
4.3.1 Eye clones ........................................................................................ 28
4.3.2 Heat-shock (follicle cell and fat body) clones................................... 30
4.3.3 Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) ............... 30
4.4 Genomic DNA extraction .......................................................................... 30
4.5 Inverse PCR ............................................................................................... 31
4.6 Sequencing ............................................................................................... 31
4.7 Southern Blot ............................................................................................ 31
4.8 mRNA quantification analysis ................................................................... 32
4.9 In situ hybridization .................................................................................. 32
4.10 Construction of βAMPK transgene ........................................................... 33
4.11 Behavioral analysis and electroretinogram (EGR) measurements ........... 33
4.12 Culture conditions and drug treatments .................................................. 34
4.13 Scanning electron microscopy .................................................................. 34
4.14 Tissue sections, histological staining and microscopy .............................. 35
4.14.1 Thick sections and hematoxylin/eosin (H/E) staining ...................... 35
4.14.2 Semi-thin sections and toluidine blue staining ................................ 35
4.14.3 Ultrathin sections and transmission electron microscopy ............... 36
4.15 Immunocytochemistry and LysoTracker staining ..................................... 36
V. RESULTS ................................................................................................................ 39
5.1 Drosophila alicorn encodes the β subunit of AMP-activated
protein kinase .......................................................................................... 39
5.2 alc is an essential gene widely expressed throughout development ....... 43
5.3 Loss of alc causes progressive neurodegeneration in the entire eyeless
expression domain ................................................................................... 43
5.4 β-AMPK does not affect photoreceptor cell polarity
and eye development .............................................................................. 48
5.5 Adult alc mutants show rapid and severe retinal degeneration .............. 51
5.6 Retinal degeneration in alc mutants is activity-dependent ...................... 54
5.7 Neurodegeneration of alc mutants is unrelated to caspase-dependent apoptosis ................................................................. 54
5.8 Ultrastructural analysis of alc mutant retinas shows signs of autophagy 57
5.9 Developmental and stress-induced autophagy is unimpaired in
alc mutant fat bodies ............................................................................... 62
5.10 Downregulation of autophagy ameliorates alc degenerative phenotype 62
VI. ADDENDUM ..................................................................................................... 67
6.1 AMPK does not rescue retinal degeneration resulting from excessive
neuronal activity ...................................................................................... 67
6.2 AMPK and TOR in parallel pathways influencing eye development? ....... 68
VII. DISCUSSION ..................................................................................................... 71
7.1 Previous findings ....................................................................................... 71
7.2 Outcomes and implications of our research ............................................. 71
7.2.1 AMPK in apico-basal polarity of epithelial and neuronal cells ......... 72
7.2.2 Cell polarity and cell division: the origin of the bristle defect? ....... 73
7.2.3 The role of alc in neuronal development, activity and survival ....... 74
7.2.4 Similarities and differences to other Drosophila
retinal degeneration mutants ......................................................... 75
7.2.5 The mechanism of neuronal death in alc mutants .......................... 75
7.2.6 A speculative model of cell death in alc mutants ............................ 78
7.3 Other prospects for future research ......................................................... 79
7.4 Supporting evidence from novel studies .................................................. 81
7.5 Concluding remarks .................................................................................. 82
VIII. Scientific publications resulting from this work ............................... 83
IX. REFERENCES ................................................................................................... 85
URI: 
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Department of Human Genetics - miscellaneous
Associated Laboratories - miscellaneous (-)
Pediatric Hematology & Oncology Section (-)

Files in This Item:
File Description Status SizeFormat
Thesis M.Spasic.pdf Published 14693KbAdobe PDFView/Open

These files are only available to some KU Leuven staff members

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.