ITEM METADATA RECORD
Title: A search for the in vivo function of the LPP protein
Other Titles: Op zoek naar een in vivo functie voor het LPP eiwit
Authors: Vervenne, Hilke
Issue Date: 30-Oct-2008
Abstract: Op zoek naar de in vivo functie van het LPP eiwit In 1996 werd het LPP (LIM domain containing preferred translocation partner in lipoma)-gen geïdentificeerd als de meest frequente translocatiepartner van HMGA2 (high mobility group A2) in een subgroep van lipomen. Lipomen zijn goedaardige vetweefseltumoren, en zijn een van de meest voorkomende tumoren van mesenchymale oorsprong in de mens. Tijdens de daarop volgende jaren werd het getrunceerde LPP-gen gedetecteerd in verschillende andere ‘soft tissue’ tumoren en in een geval van acute monoblastische leukemie. Twee onafhankelijke laboratoria identificeerden LPP bovendien als een eiwit dat sterk tot expressie komt in gladde spiercellen, en in een aanvullende studie werd in vitro aangetoond dat LPP betrokken is bij de regulatie van gladde spiercel migratie.LPP behoort tot de zyxin familie van eiwitten, waarvan zyxin en TRIP6 de meeste gelijkenissen vertonen met LPP. Al deze eiwitten bezitten meerdere eiwit-eiwit interactiedomeinen, waaronder drie carboxy-terminaal gelegen LIM domeinen. In de cel lokaliseert LPP ter hoogte van focale adhesies, i.e. plaatsen waar het celmembraan contact maakt met de extracellulaire matrix, en in cel-cel contacten. LPP interageert met VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) en a-actinine, twee eiwitten die lokaliseren op plaatsen van celadhesie. Daarnaast is LPP ook transient aanwezig in de kern, waar het fungeert als een co-activator van de ETS-domein transcriptiefactor PEA3. Palladine, een eiwit geassocieerd met actinefilamenten, kan eveneens binden aan LPP en er werd aangetoond dat beide eiwitten een actieve rol spelen in de adhesie turnover van migrerende gladde spiercellen.Een andere gekende interactiepartner van LPP in de mens is SCRIB. SCRIB is een functioneel homoloog van de Drosophila melanogaster tumorsuppressor Scribble, een eiwit dat lokaliseert in cel-cel contacten en dat betrokken is bij de controle van adhesie, vorm en polariteit van de cel. Recent werd aangetoond dat Scrib deel uitmaakt van de regulatie van ‘planar cell polarity’ (PCP) in vertebraten. PCP wordt gereguleerd door een geconserveerde signaaltransductiecascade, die de gecoördineerde bewegingen en oriëntatie van cellen of structuren binnen het vlak van een epitheel, waaronder bijvoorbeeld convergentie en extensie (C&E), medieert. C&E is een proces dat plaatsvindt tijdens de gastrulatie en resulteert in het verlengen en versmallen van de embryonale lichaamsas. Knock-down van Scrib in de zebravis leidt tot C&E-defecten, met een kortere en bredere lichaamsas tot gevolg.Een functie voor de LPP-SCRIB-interactie werd tot op heden nog niet geïdentificeerd. Hoewel tijdens het voorbije decennium veel informatie werd verzameld over LPP, is er nog steeds niets geweten over de biologische functie van LPP in de complexe context van een volledig organisme. Om de in vivo functie van LPP te achterhalen, hebben we gebruik gemaakt van diermodellen waarin het LPP-ortholoog functioneel werd geïnactiveerd of gedownreguleerd. In een eerste benadering hebben we een morfolino-gemedieerde ‘knock-down’ uitgevoerd van het LPP-ortholoog (Lpp) in zebravis embryo’s. Bij de analyse van het fenotype hebben we ons specifiek geconcentreerd op het identificeren van een mogelijke rol voor LPP in de regulatie van PCP, en op het zoeken van een mogelijke functie voor de LPP-SCRIB-interactie. We hebben kunnen aantonen dat knock-down van Lpp in de zebravis resulteert in typische C&E-defecten, en we hebben bewezen dat een verminderde dorsale migratiecapaciteit aan de basis ligt van dit fenotype. Bovendien toonden we ook aan dat Lpp en Scrib genetisch en fysisch interageren in de zebravis, en dat beide eiwitten samenwerken voor de regulatie van C&E. Op deze manier hebben we voor de eerste keer een mogelijke functie voor de LPP-SCRIB-interactie beschreven. Genetische manipulatie van heel wat focale adhesie eiwitten resulteert in defecten van celadhesie, -spreiding en -migratie. Bij het begin van dit doctoraat waren vier Lpp+/- chimere muizen aanwezig, en het tweede doel van dit project was dan ook het genereren van een Lpp-knockout muizenlijn en het bestuderen van deze muizen op de aanwezigheid van defecten tijdens bovenvermelde processen.Lpp-knockout-muizen zijn levensvatbaar en vruchtbaar, en vertonen geen duidelijke macroscopische afwijkingen. Het aantal vrouwelijke Lpp-knockouts dat geboren werd uit heterozygote kruisingen was echter lager dan verwacht volgens de Mendeliaanse genetica, wat suggereert dat er een gedeeltelijke lethaliteit is van vrouwelijke Lpp-/--embryo’s. Bovendien werden ongeveer 50% minder muizen geboren uit Lpp-/- x Lpp-/- kruisingen in vergelijking met wild-type kruisingen. Aangezien we hebben aangetoond dat de fertiliteit van de Lpp-/--mannetjes normaal is, suggereert deze observatie de aanwezigheid van een fertiliteitsprobleem bij de Lpp-/--vrouwtjes.Lpp-/- embryonale fibroblasten van de muis (MEFs) bezitten een verminderde leefbaarheid en migratie capaciteit in vergelijking met Lpp+/+-MEFs. Daarnaast bleek ook dat afwezigheid van Lpp leidt tot een verminderde expressie van de interactiepartners Scrib, a-actinine en PR130. Dit suggereert dat Lpp – direct of indirect – betrokken is bij de regulatie van de expressie en/of de stabiliteit van deze eiwitten. Er werd al eerder aangetoond dat LPP betrokken is bij de regulatie van gladde spiercel migratie, een proces waarvan geweten is dat het bijdraagt tot de ontwikkeling van atherosclerotische plaques. In een derde deel hebben we daarom Lpp/ApoE-dubbele knockout-muizen gegenereerd om de mogelijke rol van Lpp tijdens atherosclerose te bestuderen.De voorlopige resultaten van onze experimenten toonden geen verschil aan in hoeveelheid, grootte en verdeling van de plaques, noch van het serumcholesterolniveau tussen Lpp/ApoE-dubbele knockouts en ApoE-knockout controles. Grotere aantallen muizen zullen echter bestudeerd moeten worden om statistisch betrouwbare resultaten te verkrijgen, vooraleer finale conclusies getrokken kunnen worden over de rol van Lpp in atherosclerose. We kunnen besluiten dat Lpp een belangrijke rol speelt tijdens in vivo celmigratie. Meer specifiek toonden we zowel in de zebravis als in de muis aan dat afwezigheid van Lpp leidt tot een duidelijk verminderde capaciteit van cellen om te migreren in een welbepaalde richting. Het is opmerkelijk dat het verlies van deze functie tot ernstige C&E-defecten leidt tijdens de zebravisgastrulatie, terwijl slechts een mild fenotype wordt waargenomen na het uitschakelen van Lpp in de muis. Mogelijk bezitten een of meerdere familieleden van Lpp overlappende functies en kan hun aanwezigheid op deze manier compenseren voor het verlies van Lpp. Het genereren en bestuderen van dubbele en/of driedubbele knockout-muizen kan in de toekomst een antwoord bieden voor deze intrigerende kwestie.
URI: 
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Associated Laboratories - miscellaneous (-)
Laboratory for Intensive Care Medicine (-)
Department of Human Genetics - miscellaneous
Clinical Genetics Section (-)

Files in This Item:
File Description Status SizeFormat
thesis manuscript Hilke Vervenne.pdf Published 4924KbAdobe PDFView/Open

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.