Author:

Abstract:

Arabinoxylan, afkomstig uit graangewassen, bestaat voornamelijk uit een beta-1,4 koppeling van xylose-eenheden die gesubstitueerd kunnen zijn met arabinose, beta-D-glucuronosyl of zijn 4-O-methyl derivaat, en/of met acetyl zijketens. Feruline- en/of p-coumarinezuur kunnen, via verestering met de C5-positie van sommige arabinose-eenheden, covalent verbonden zijn met de arabinoxylan-structuur (Hoofdstuk 1). Omwille van deze chemische en fysische complexiteit van arabinoxylan vereist een volledige enzymatische afbraak een verscheidenheid aan enzymen. De zijketens van de arabinoxylan-hoofdketen worden vrijgesteld door middel van alpha-L-arabinofuranosidase, beta-D-glucuronidase, feruloyl- en acetylxylan-esteraseactiviteit, terwijl het depolymeriseren van arabinoxylan steunt op de werking van endoxylanase- en beta-xylosidaseactiviteit (Hoofdstuk 2). Endoxylanasen werden gedurende de laatste 10 jaar aandachtig bestudeerd wegens hun grondige impact op de functionaliteit van arabinoxylan. Bijgevolg worden ze frequent toegepast in verscheidene industriële processen (Hoofdstuk 2). Ze worden regelmatig gebruikt in de broodbereiding en gluten-zetmeelscheiding omdat ze een gunstig effect hebben op het proces en/of het verbeteren van de kwaliteit van het eindproduct. Desondanks is de bruikbaarheid van endoxylanasen in dergelijke processen sterk afhankelijk van twee belangrijke enzym-eigenschappen, namelijk de substraatselectiviteit en de inhibitiegevoeligheid. Arabinoxylan komt in twee vormen voor: water-extraheerbaar en niet-water-extraheerbaar. Beide vormen hebben elk hun eigen fysicochemische eigenschappen (Hoofdstuk 1). Endoxylanasen kunnen enerzijds niet-water-extraheerbaar arabinoxylan hydrolyseren waarbij enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan wordt vrijgesteld. Anderzijds kunnen zij water-extraheerbaar en enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan degraderen tot arabinoxylanfragmenten met een laag moleculair gewicht. Afhankelijk van de industriële toepassing is een voorkeur van het endoxylanase voor één van beide vormen gewenst, terwijl de activiteit ten opzichte van de andere populatie ongewenst is (Hoofdstuk 2). Bijgevolg zal de substraatselectiviteit een belangrijke invloed hebben op de functionaliteit van deze enzymen. Een tweede belangrijke eigenschap is de inhibitiegevoeligheid. De aanwezigheid van proteïnen in graangewassen met endoxylanase inhiberende capaciteit kan een sterke invloed hebben op de functionaliteit van endoxylanasen. Tot op heden kon men drie verschillende inhibitoren isoleren, namelijk TAXI (Triticum aestivum xylanase inhibitor), XIP (xylanase inhibitor protein) en TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor) (Hoofdstuk 3). De doeltreffendheid van arabinofuranosidasen in de afbraak van arabinoxylan wordt hoofdzakelijk bepaald door hun substraatspecificiteit en hun vermogen om diverse arabinosezijketens af te splitsen (Hoofdstuk 2). Afhankelijk van hun substraatspecificiteit, worden arabinofuranosidasen in drie groepen verdeeld. Type A hydrolyseert enkel arabinoseijketens van oligosachariden, type B hydrolyseert arabinosezijketens van zowel oligosachariden als polymeren en type C is enkel actief op arabinoxylo-oligosachariden en arabinoxylan. Arabinoxylan bevat zowel mono- als di-gesubstitueerde xylose-eenheden. De specifieke hydrolyse van één of beide substituenten bepaalt de voorkeur van deze enzymen. Het xylanolytische systeem van B. subtilis werd een tiental jaar geleden ontrafeld door middel van een genomische karakterisering. Niettegenstaande op deze manier de verschillende leden geïdentificeerd werden, waren enkele leden aan het begin van dit onderzoek nog niet gekarakteriseerd. In deze studie wordt de recombinante expressie, opzuivering en biochemische karakterisering van deze endoxylanasen en arabinofuranosidasen van B. subtilis beschreven. Bij de aanvang van dit doctoraatsonderzoek was één endoxylanase van B. subtilis, namelijk BsXynA, beschikbaar als additief in de broodbereiding met als doel het broodvolume te vergroten. Om meer inzicht te krijgen in de selectiviteit en inhibitiegevoeligheid van BsXynA, is het van cruciaal belang om een goed recombinant expressie-systeem gekoppeld aan een eenvoudig opzuiveringsprotocol te verkrijgen. Daarom werden twee organismen gescreend voor recombinante expressie, waarbij de expressie van de xynA coderende sequentie in Escherichia coli de hoogste opbrengst aan recombinant BsXynA vertoonde. Dit recombinant enzym kan vervolgens gebruikt worden als referentie ten opzichte van de verschillende varianten, aangemaakt in Hoofdstukken 8 en 9. Groeiexperimenten met B. subtilis waarbij xylose als koolstofbron werd gebruikt, duidden op de secretie van nog twee andere vermeende endoxylanasen naast BsXynA, namelijk BsXynC en BsXynD. Beide enzymen werden recombinant aangemaakt in E. coli en biochemisch gekarakteriseerd zoals beschreven in Hoofdstukken 5 en 6. BsXynC, een glucuronoxylanase, vertoonde een voorkeur voor de hydrolyse van niet-water-extraheerbaar arabinoxylan naar enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan. Ten tweede werd de activiteit van BsXynC niet beïnvloed in aanwezig van inhibitoren. Omwille van deze twee eigenschappen werd BsXynC getest in de broodbereiding (Hoofdstuk 5). BsXynD daarentegen, vertoonde geen endoxylanaseactiviteit. Door zijn activiteit te testen op verschillende substraten, werd duidelijk dat BsXynD gelijkenissen vertoonde met gekende arabinoxylan arabinofuranohydrolasen. Het hydrolyseerde namelijk alpha-L-arabinose van mono-gesubstiteerde xylopyranoside-eenheden (Hoofdstuk 6). Via een structurele analyse werd deze biochemische karakterisering bevestigd. Naast de twee endoxylanasen en het xylan arabinofuranohydrolase, werden door B. subtilis nog twee arabinofuranosidasen intracellulair tot expressie gebracht. De recombinante expressie, opzuivering en biochemische karakterisering wordt beschreven in Hoofdstuk 7. Gebaseerd op de biochemische karakterisering en een structureel model, kan verondersteld worden dat BsAbfA enkel alpha-L-arabinose hydrolyseert van xylose-eenheden die aan het niet-reducerend uiteinde van het substraat gelegen zijn. Daarentegen hydrolyseert BsXsa enkel de alpha-L-arabinoseresidu's van de interne mono-gesubstituteerde xylose-eenheden. Gebaseerd op deze resultaten, kan verondersteld worden dat B. subtilis niet in staat is glucuronosyl- en di-gesubstituteerde arabinose-substituenten van xylose-eenheden af te splitsen. Om meer inzicht te krijgen in de mechanismen die aan de basis liggen van de belangrijkste enzym-eigenschappen die een invloed hebben op de functionaliteit van endoxylanasen in graanverwerkende toepassingen, namelijke endoxylanasesubstraatselectiviteit en inhibitiegevoeligheid, wordt plaatsgerichte mutagenese toegepast op BsXynA. Gebaseerd op de idee dat verschillen in oppervlakte-hydrofobiciteit van endoxylanasesn mogelijks verantwoordelijk zijn voor een verschillende endoxylanase substraatselectiviteit, werden endoxylanasen met lager aantal oppervlakte hydrofobe residu's ontwikkeld en aangemaakt (Hoofdstuk 8). Verscheidende varianten resulteerden in een lagere substraatselectiviteitsfactor in vergelijking met het wildtype endoxylanase. Dit weerspiegelt het belang van enkele specifieke aromatische residu's aan het oppervlak en/of nabijgelegen residu's in de substraatbinding bij de afbraak van arabinoxylan. Gebaseerd op het structureel inzicht van het complex tussen Aspergillus niger endoxylanase ExlA en TAXI-I, worden varianten van BsXynA ontwikkeld om het mechanisme van de inhibitiegevoeligheid, de tweede belangrijke parameter, te achterhalen (Hoofdstuk 9). Twee verschillende strategieën werden hierbij gebruikt: (i) introductie van sterische hindering of (ii) verbreking van de sleutelinteracties tussen inhibitor en endoxylanase ter hoogte van de substraat-bindingsgroeve. De eerste strategie werd met succes toegepast op positie G12 waar G12W inhibitie-ongevoeligheid combineert met een behouden katalytische werking. Varianten, gebaseerd op de tweede strategie, vertoonden een gewijzigde inhibitor-gevoeligheid samengaand met gewijzigde enzymactiviteit. Deze varianten lieten toe om meer inzicht te krijgen in de bindingsprocedure tussen TAXI-I en TAXI-II met BsXynA.