ITEM METADATA RECORD
Title: Reporter gene-based non-invasive imaging in rodent brain
Other Titles: Reportergen-gebaseerde niet-invasieve beeldvorming in knaagdierhersenen
Authors: Vande Velde, Greetje
Issue Date: 29-Apr-2010
Abstract: Samenvatting Moleculaire beeldvorming is een zeer waardevolle techniek, o.a. omdat he t dynamische beeldvorming van de voortgang van een ziekteproces, genexpr essie of therapeutische interventies in een individueel proefdier mogeli jk maakt. Het hier gepresenteerde werk heeft tot doel bij te drage n tot dit onderzoek d.m.v. de ontwikkeling van moleculaire beeldvormings methodes gebaseerd op reportergenen. In ons laboratorium worden le ntivirale (LV) en adeno-geassocieerde virale (AAV) vectortechnologie aan gewend voor het tot overexpressie brengen of onderdrukken van genen die betrokken zijn bij PD en voor het creëren van diermodellen van deze aand oening, met het oog op het ontwikkelen van gen- en celtherapeutische str ategieën voor PD. Reportergen-gebaseerde beeldvorming voor toepassing in cel- en gentherap ie veronderstelt vaak de expressie van meerdere transgenen vanaf hetzelf de vectorconstruct. Wij vergeleken de beschikbare mogelijkheden vo or bicistronische genexpressie met betrekking tot het bereiken van de me est efficiënte gecombineerde expressie en acitiviteit van twee reporterg enen in de context van LVn in celcultuur en in muizenhersenen. LV- gemedieerde bicistronische genexpressie in muizenhersenen is mogelijk do or gebruik te maken van een EMCV IRES-sequentie of van 2A-gelijkende seq uenties. Daarenboven overtreffen 2A-sequenties het IRES-element op het vlak van hogere reportergenexpressieniveaus in vitro alsook in vivo en temeer door hun beperkte grootte. Dit laatste maakt het mogeli jk om multicistronische vectoren te ontwerpen die nu gebruikt worden in verschillende onderzoeksprojecten binnen en buiten onze onderzoeksgroep. De Ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende neurodegener atieve aandoening. Het bestuderen van de genen betrokken in familiale vo rmen van deze ziekte, zal bijdragen tot het ontcijferen van de pathogene se van deze aandoening, die tot nu toe niet gekend is. Een gelokaliseerd transgeen diermodel voor PD gebaseerd op LV-gemedieerde overexpressie v an α-synucleïne werd eerder al ontwikkeld in ons laboratorium. Dit diermodel kan gebruikt worden om de effecten van andere PD-ge associeerde genen op de aggregatie van α-synucleïne na te gaan en om therapeutische strategieën te testen. Dit onderzoek zou enorm voo ruit geholpen worden wanneer we de effecten van experimenteel handelen o f van therapeutische strategieën op de neurodegeneratie niet-invasief zo uden kunnen opvolgen in de tijd in dit proefdiermodel. Daarom onde rzochten we in dit werk de mogelijkheid om bioluminescentiebeeldvorming (BLI) aan te wenden voor de niet-invasieve opvolging van neurodegenerati e in het α-synucleïne-gebaseerde muismodel voor PD. Daartoe on twierpen we LV en AAV waarmee we een specifieke celpopulatie kunnen mark eren, door ons te baseren op een conditioneel expressiesysteem dat stoel t op het principe van Cre-loxP recombinatie in een Cre-transgene muis. W e toonden aan dat we met deze AAV-FLExSwitch vectoren α-synucl eïne specifiek en efficiënt tot overexpressie kunnen brengen in de dopam inerge neuronen van de substantia nigra en dat we ze naderhand kunnen vi sualiseren met BLI. Deze technologie wordt geïmplementeerd voor de niet-invasieve opvolging van de PD-gerelateerde neurodegeneratie in dit verbeterde proefdiermodel voor PD en kan uitgebreid worden naar andere, bijvoorbeeld neurotoxische diermodellen voor PD. Omdat de spatiale resolutie van BLI beperkt is en tomografische beeldvor ming niet mogelijk is, zou het combineren van BLI met een andere beeldvo rmingsmodaliteit, met name MRI, visualizatie van de exacte locatie van d e gemarkeerde cellen in drie dimensies mogelijk maken en dit met uitstek end contrast in zachte weefsels zoals in de hersenen. Wij evalueer den het potentieel van LV en AAV vectoren voor de overexpressie van ferr itine, een mogelijk reportergen voor MRI, in muizenhersenen. Eerst verge leken we de inductie van achtergrondcontrast op MRI voor beide vectorsys temen en dit zowel in immuungecompromitteerde als in immuuncompetente di eren. Na LV-injectie in de hersenen observeerden we hypointense verander ingen in T2/ T2*-gewogen MRI ter hoogte van de injectieplaats, wat grote ndeels verklaard kon worden door een ontstekingsreactie tegen de vectori njectie. In tegenstelling tot LV-injectie, veroorzaakte de AAV-injectie zeer weinig achtergrondcontrast en AAV-gemedieerde ferritine-overexpress ie resulteerde in significant contrast boven achtergrond op T2*-gewogen MRI. Hoewel de gevoeligheid geassocieerd met deze ferritinereporte r bescheiden blijft, betekenen deze resultaten dat AAV vectoren de meest belovende optie zijn voor reportergen-gebaseerde MRI. Dit werk droeg bij tot de ontwikkeling van verbeterde LV en AAV vectoren voor efficiënte, multicistronische genexpressie en specifieke markering van bepaalde celpopulaties. Deze technologie wordt nu gebruikt voor ver schillende toepassingen waaronder neurobiologische studies, de ontwikkel ing van moleculaire beeldvormingsstrategieën en voor de optimalisatie va n lokaal-transgene diermodellen. Dit werk legt een basis voor verdere on twikkelingen in reportergenbeeldvorming voor onderzoekstoepassingen in h et domein van de neurowetenschappen.
Table of Contents: Table of Contents

Table of Contents .................................................................................................................................... 6
Abbreviations ........................................................................................................................................... 8
Aims and outline of this work ................................................................................................................. 10
Chapter 1: Introduction .......................................................................................................................... 13
1. Parkinson‟s Disease .................................................................................................................. 13
2. Non-invasive imaging using BLI and MRI ................................................................................. 16
2.1. Bioluminescence imaging (BLI) ......................................................................................... 16
2.2. Magnetic resonance imaging (MRI)................................................................................... 19
3. Viral vectors for stable gene transfer ......................................................................................... 30
3.1. Lentiviral vectors (LVs) ...................................................................................................... 30
3.2. Adeno-associated viral vectors (rAAV) .............................................................................. 36
Chapter 2: Materials & Methods ............................................................................................................ 37
1. Viral Vectors .............................................................................................................................. 37
2. Cell experiments ........................................................................................................................ 40
3. Cell imaging ............................................................................................................................... 41
4. In vivo experiments .................................................................................................................... 42
5. In vivo imaging ........................................................................................................................... 43
6. Ex vivo validation ....................................................................................................................... 45
Chapter 3: Results & Discussion ........................................................................................................... 47
1. Optimization of multicistronic lentiviral vectors for efficient non-invasive imaging of gene
expression in rodent brain ..................................................................................................... 47
1.1. Construction of different bicistronic lentiviral transfer plasmids ........................................ 47
1.2. Evaluation of different bicistronic LV constructs in cultured cells ...................................... 48
1.3. Evaluation of reporter gene activity ................................................................................... 50
1.4. Construction and evaluation of additional 2A-like peptide sequences .............................. 52
1.5. Bicistronic reporter gene activity in vivo ............................................................................ 54
1.6. Construction of a triple reporter vector with 2A-like peptides ............................................ 56
1.7. Evaluation of the triple reporter lentiviral vector in vivo ..................................................... 57
1.8. Discussion ......................................................................................................................... 59
2. Validation of BLI for non-invasive imaging of α-synuclein expression and neurodegeneration in
mouse brain ........................................................................................................................... 63
2.1. Construction of conditional LV and AAV vectors ............................................................... 63
2.2. Validation of LV and AAV FLExSwitch constructs in cell culture ...................................... 64
2.3. Validation of the FLExSwitch vectors in vivo ..................................................................... 66
2.4. Validation of LV and AAV FLExSwitch vectors in mouse brain ......................................... 67
2.5. Specific transgene expression in dopaminergic neurons mediated by AAV-FLExSwitch. 69
2.6. Discussion ......................................................................................................................... 73
3. Evaluation of lentiviral and adeno-associated viral vector systems for ferritin expression as MRI
reporter gene in mouse brain ................................................................................................ 77
3.1. Lentiviral vectors encoding ferritin induce iron accumulation and MR contrast in cultured
cells ............................................................................................................................ 77
3.2. Control lentiviral vector injection in rodent brain induces background contrast in MRI ........ 80
3.3. The MRI background contrast induced by a control LV is reduced in immune deficient mice
................................................................................................................................... 82
3.4. The hypointense MRI contrast induced by FerrH-LV after injection in mouse brain is not
significantly different from the contrast of a control LV................................................ 82
3.5. AAV vectors induce lower MRI background contrast in mouse brain than LV .................... 83
3.6. AAV-mediated FerrH expression induces specific MRI contrast in mouse brain ................. 85
3.7. Discussion ......................................................................................................................... 86
Chapter 4: General conclusions & perspectives ................................................................................... 89
Summary ............................................................................................................................................... 92
Samenvatting ......................................................................................................................................... 94
References ............................................................................................................................................ 96
Curriculum Vitae .................................................................................................................................. 112
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Research Group for Neurobiology and Gene Therapy
Biomedical MRI
Molecular Virology and Gene Therapy
Faculty of Medicine, Campus Kulak Kortrijk

Files in This Item:
File Status SizeFormat
PhD thesis GVV.pdf Published 3600KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.