ITEM METADATA RECORD
Title: Insights in platelet integrin alpha 2 beta 1 affinity modulation.
Other Titles: Inzichten in affiniteitsmodulering van het bloedplaatjesintegrine alfa 2 beta 1.
Authors: Iserbyt, Brecht
Issue Date: 27-Apr-2010
Abstract: Bloedplaatjes zijn kleine kernloze cellen die in de bloedbaan vertoeven als inerte cellen en als belangrijkste functie hebben bloedingen te stelpen. Dit gebeurt door zic h vast te hechten op plaatsen waar de bloedvatwand beschadigd raakte. Wanneer dit complexe en uitgebal anceerde proces ontaart kan dit aanleiding geven tot diverse pathologieën zoals bloeding stoornissen of tromboses. Om ons toe te laten producten te ontwikkelen die kunnen voorkomen dat de rgelijke geharmonieerde processen ontsporen is het noodzakelijk om een diepgaand inzicht te verw erven in de mechanismen die achter dit proces schuilgaan. Wanneer een bloedvatwand beschadigd ra akt, worden verschillende subendotheliale weefselcomponenten blootgesteld aan het bloed door de lo cale verwijdering van endotheliale cellen van de vaatwand. Het meest trombogene eiwit in deze matrix is collageen waarop bloedplaatjes (in)direct kunnen binden. Het integrine α 2ß1 is één van de twee belangrijkste receptoren betrokken in de directe binding van bloedplaatjes aan collage en en meteen ook het onderwerp van deze studie. Receptoren binnen de groep van integrines hebben eenzelfde opbouw van do meinen en tenminste een deelgroep, de zogenaamde niet-I-domein integrines zoals αV ß3 en α5ß1, delen een gemeenschappelijke ectodomein structuur. Voor I-domein integrines, geken merkt door een extra of geïnsereerd (I) domein, is tot dusver nog geen volledige structuur besch ikbaar. Voor deze receptoren kan echter het geïsoleerde αI-domein gebruikt worden als model systeem doordat het recombinant aangemaakt kan worden en hierbij toch de ligand specificiteit, affinitei t en voorkeur voor kation en van de volledige molecule behoudt. Naast grote overeenkomsten in de αI-domein kristalstructuur va n de integrines αMß2, αLß2, α1&# 946;1 en α2ß1, vertonen deze I-domeinen ook heel gelijkaardige conformatieveranderingen bij overgang van de lage naar de hoge affiniteitsvorm. Niettegenstaande de veranderin gen aan de top van het domein een eerder subtiel karakter hebben, hebben ze wel een diepgaand e ffect op de affiniteit van het domein voor zijn ligand. Een opmerkelijk gebeuren is verder de grote neerwaartse verplaatsing van de C-terminale α7-helix die hiermee gepaard gaat. Het beko men van een hoge affiniteitsvorm door de beïnvloeding van de positie van deze helix is dan ook het hoofdd oel van de meeste mutagenesestudies. Deze visie werd in dit werk doorgetrokken naar het in tegrine α2ß1 om na te gaan in hoeverre dit integrine dezelfde modus operandi heeft als de ande re I-domein integrines. Hiervoor hebben we vervangingen aangebracht in het α2ß1 I -domein, op posities homoloog met reeds beschreven residuen in andere integrines. De grote toename in affi niteit van het α2I-domein door het vervangen van Glu318 door een tryptofaan (E318W) bevestigt dat de α7-helix ook voor dit integrine een goed doel is voor mutagenese. Het vervangen van Leu173 doo r een tryptofaan (L173W) al dan niet in combinatie met de E318W mutatie doet de affiniteit van he t domein bijna volledig verloren gaan, in tegenstelling tot analoge studies in het αMI -domein. Het effect wordt hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door het beperken van de bewegingsvrijh eid van de α7-helix wat dan ook het dominant karakter van deze mutatie op de E318W mutatie verkl aart. Verrassend was wel dat CHO cellen die de volledige receptor met E318W mu tatie tot expressie brengen een veel lagere bindingsgraad dan cellen met een wild type recep tor vertonen. De binding kon daarenboven hersteld worden door de bijkomende mutatie, L173W. Merkw aardig genoeg leidt de L173W op zichzelf ook nog tot een verschil in lig and voorkeur van de CHO cellen, nl. in tegenstelling tot de binding op collageen type III, is de binding aan co llagen type I sterk verminderd. Deze resultaten doen vermoeden dat naast de eerder vermelde bijkomende b indingsplaatsen van collageen aan het α2I-domein, ook andere integrinedomeinen, me t in het bijzonder de ß-propeller en het ß-I-like domein, een rol spelen in de volledige recepto r die belangrijker is dan tot nog toe gedacht werd. De hierboven beschreven conformatieveranderingen, hier veroorzaakt door geïntroduceerde aminozuurveranderingen, worden onder normale omstandigheden gestuurd van binnenin de cel. Hiervoor zijn de cytoplasmatische gebieden van integrines belangrijk, da ar zij als een soort verzamelplaats fungeren voor proteïnen die een ‘inside-out’ signalisatie kunnen induceren. Dergelijke proteïnen die interageren met de zogenaamde integrine ‘staart en’ werden opgespoord met een ‘yeast-two-hybrid’ experiment. De meest geschikte kandidaat voor de α2 en ß1 staart werd geselecteerd voor verder onderzoek naar een mogelijke rol in de functie van α2ß1, resp. de eiwitten RhoGDI-ß en Slap-2. Wanneer we de kleine G-proteine inhibitor RhoGDI-ß tot overexpressi e brachten in Jurkat cellen bleek dat deze een inhibitorische werking heeft op de α2ß 1-afhankelijke statische binding aan collageen. De binding kon hersteld worden tot op rustend wild type nivea u wanneer de Jurkat cellen gestimuleerd werden. De overexpressie van Slap-2 in Jurkat cellen daaren tegen induceerde een toename van de binding van de cellen aan collageen, vergelijkbaar met da t van wild type Jurkat cellen die gestimuleerd werden. Bovendien bleken beide stimulerende effe cten cumulatief wat resulteert in een nog meer uitgesproken binding van deze cellen aan coll ageen. Het is duidelijk dat RhoGDI-ß en Slap-2 tegengestelde effecten veroorzaken bij overexpre ssie in Jurkat cellen, die zelfs bijkomende stimulatie van de cellen weerstaan. Desondanks kan het dat de ze effecten via gelijkaardige mechanismen veroorzaakt worden. Zo worden door de overexpr essie van deze eiwitten mogelijks cytosolische eiwitten weggekaapt of weggecompeteerd van hun bi ndingsplaats op de integrine’staarten’ en zo dus verhinderd in hun functie. Dergelijke integrine-bindende eiwitten zijn taline en kindline, onontbee rlijke spelers voor de activatie van integrines van binnen uit is door het binden op verschillende plaats en van de ß integrinestaarten. Niettegenstaande het uitblijven van spreiding van bloedplaatjes deficiën t in taline of kindline-3 op ß1 of ß3 integrine ligand, blijft het gissen naar hoe deze eiwitt en samenwerken in de ‘outside-in’ en inside-out’ signalisatie. In onze experimenten werd met behulp van ß1-ß7 chimere peptiden bepaald dat de bindingsplaats van Slap-2 in de 12 membraanproximale ß1 -residuen ligt, stroomopwaarts van de taline bindingsplaats. Volgens deze gegevens zouden Slap-2 en taline mogelijk elkaars interactie met de ß1 integrinestaart kunnen bevorderen, waarbij het hier waarschijnlijk om een heel specifiek mechanisme gaat daar Slap-2 een haemotopoietisch expressiepatroon vertoo nt. Een bijkomende manier om de functie van Slap-2 te bepalen was het gebrui k van knock out muizen. Hier echter konden behalve een toename in GPVI expressie niveau’s, een v erminderd aantal plaatjes in het bloed en een verminderd staartbloedingsvolume, geen afwijkingen v astgesteld worden met betrekking tot de functie van de bloedplaatjes. Het is echter best mogel ijk dat in tegenstelling tot het duidelijk effect dat overexpressie van Slap-2 had, hier het gebrek aan e ffect dient te worden toegeschreven aan het voorkomen van eiwitten die in de knock out cellen de functie van Slap-2 kunnen overnemen. Het heersende model voor de opeenvolging van gebeurten issen bij bloedstolling is er een waarbij bloedplaatjes in de eerste plaats afgeremd worden door binding van de GP Ib receptor op VWF, waardoor de plaatjes de kans krijgen om stabiel te binden op collageen v ia GPVI en integrine α2ß1 en vervolgens aggregaten vormen door het crosslinken van integrine αIIbß3 via fibrinogeen. Deze interacties worden bestendigd door een aanhoudende stroom van activatore n, zoals ADP en tromboxaan A2, om blijvende aggregaatvorming te verzekeren. Bovendien is vastgesteld dat er een ingewikkeld kluwen van samenspel is tussen receptoren, vaak ‘cross talk’ genoemd. Onze resultaten tonen aan dat dergelijk samenspel van αIIbß3 naar &# 945;2ß1 noodzakelijk is voor activatie van deze laatste. In afwezigheid van fibrinogeen of van zijn receptor α IIbß3, bleef de activatie van α2ß1 uit, maar kon hersteld worden door toevoegen van het ligand zoals fibrinogeen of het ligand nabootsend RGDS peptide. Het klassieke concept van integrine receptoren omvat unidirectionele ver anderingen in de receptorstructuur om de hoge affiniteitsvorm te bereiken. Het overzicht dat in dit werk weergegeven wordt, toont aan dat dit proces reversibel is in bepaalde omstandigheden . Voor de blijvende activatie van het integrine αIIbß3 is een aanhoudende ADP stimulati e van de P2Y12 receptor vereist. Zoniet desaggregeren de bloedplaatjes en zou mogelijk, door het eerder beschrev en samenspel, de activatie van α2ß1 en dus de bloedplaatjesaanhechting in het gedran g kunnen komen. Het reeds complex geheel van de regulatie van de integrine activiteit do or de conformatieveranderingen, samen met het ingewikkeld samenspel tussen rec eptoren onderling, vormt een boeiende uitdaging om de onderliggende mechanismen verder uit te diepen en zo mogelijks heel specifieke interactoren te kunnen ontwikkelen die interfe reren met dit proces en die zouden kunnen worden ingezet in tal van pathologieën.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Interdisciplinary Research Facility Life Sciences, Campus Kulak Kortrijk
Chemistry, Campus Kulak Kortrijk

Files in This Item:
File Status SizeFormat
PhD thesis Brecht Iserbyt 27Apr2010.pdf Published 22525KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.