ITEM METADATA RECORD
Title: Ttrap: aspects of its biochemistry and generation of mutant mouse models
Other Titles: Ttrap: biochemische aspecten en generatie van mutante muismodellen
Authors: Vermeire, Liesbeth
Issue Date: 23-Feb-2010
Abstract: Sequentie informatie over de vele genen die ons maken tot wat we zijn, i s beschikbaar geworden sinds de vervollediging van het Humaan Genoom Pro ject. Echter, er is maar van een beperkt aantal genen ook informatie beschikbaar over hun expressie en functie. De zeer gedetaille erde functionele annotatie van het humane genoom, en het linken van deze informatie met menselijke ziektes, is dan ook de grootste uitdagi ng voor de komende decennia. Genetica linkt mutaties met fenotypes en vice versa, maar gezien spontan e mutaties maar zelden voorkomen, zijn muismodellen gegenereerd via muta genese onmisbaar geworden. De muis is een excellent modelorganisme om de functie van humane genen te ontrafelen, omwille van zijn acceptabele an atomische, fysiologische en genetische gelijkenissen met de mens. Daarom is veel energie geïnvesteerd in het ontwikkelen van verschillende strat egieën om mutante muizen te genereren, die de ontwikkeling van de mens en zijn ziektes meer precies kunnen nabootsen. TRAF en TNF receptor geassocieerd proteïne (TTRAP) werd ontdekt in het g astlaboratorium in een gist-2-hybride screening met het cytoplasmatisch gedeelte van CD40 als a as. TTRAP interageert niet alleen met receptoren van de TNF familie, maa r ook met TRAF proteïnen, en oefent mogelijks een functie uit als negati eve regulator van NF-kB-gemedieerde signalisatie. TTRAP werd ook geïdent ificeerd als Ets-geassocieerd proteïne (EAPII), met een mogelijke rol in de modulatie van transcriptie factor activiteit, maar ook kanker metast ase. Bovendien werd de interactie tussen TTRAP en zowel receptoren als i ntracellulaire mediatoren van de TGFb signalisatie cascade gedocumenteer d, wat mogelijks TTRAP plaatst op de kruising van verschillende signalis atie cascades van de plasmamembraan tot aan de kern, waarbij het extrins ieke groeifactor/cytokine signalisatie linkt met een transcriptionele re spons in de gestimuleerde cel. Morfolino-gemedieerde neerregulatie van Ttrap in de z ebravis toonde aan dat Ttrap belangrijk is voor gastrulatie en links-rechts asymmetrie in de vroege z ebravis ontwikkeling. Deze effecten verlopen via Smad3-gemedieerde regul atie van E-cadherine gen expressie, mogelijks via nodal-Alk4-Smad3 gereg uleerde expressie van de transcriptionele repressor Snail. Hoewel zebrav is een zeer nuttig modelorganisme is omwille van zijn snelle generatie tijd en het f eit dat de embryo’s transparant zijn, wordt het toch niet vaak gebruikt om gen functies te extrapoleren naar de mens. Daarom werd beslist in dit doctoraat Ttrap mutante muismodellen te genereren om zijn in vivo funct ie te ontrafelen en mogelijks onze bevindingen te extrapoleren naar huma ne ontwikkeling en ziektes. Een tweede doel van dit doctoraat is de verd ere karakterisatie van de biochemische functie(s) van het TTRAP proteïne . In een eerste benadering om een Ttrap mutante muis te genereren, hebben we gebruik gemaakt van een beschikbare gene trap ES cellijn. In de Ttrap gene trap ES cellijn RRS512 is een gene trap vector met een bGeo f usie reporter gen geïntegreerd in intron 5 van Ttrap. Hoewel de initiële karakterisatie van de ES cellijn (het bepalen van de exacte insertie pl aats, de aanwezigheid van de splice acceptor plaats, en de vorming van h et correcte fusie transcript) correct leek te zijn, kwamen verschillende problemen aan het licht na een meer gedetailleerde analyse van de gegen ereerde mutante muizen. In dit specifiek geval, hebben we gevonden dat e r tenminste 40 kopieën van de gene trap vector geïntegreerd waren, waars chijnlijk in dezelfde locus. Nog belangrijker, ondanks deze insertie, ex presseerden de homozygote mutante gene trap muizen nog steeds wildtype T trap mRNA. Via quantitatieve PCR analyse konden we aantonen dat er een d uplicatie was opgetreden van wildtype Ttrap exon 1-5 op het gene trap al lel. Deze zeer zeldzame vorm van reconstitutie van de wildtype functie i n een gene trap achtergrond verhinderde de mogelijke analyse van de rol van Ttrap tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis. Als tweede methode maakten we gebruik van de recent ontwikkelde shRNAmir technologie om een gen neer te reguleren in vivo in oocyten. Pronucleai re injectie van een plasmide dat een shRNAmir gericht tegen het gen van interesse bevat, laat toe om inzicht te verwerven in de in vivo functie van dat gen op een zeer snelle, hoewel minder precieze, manier. Het plas mide zal integreren in het genoom en zal blijvend de shRNA sequentie pro duceren en dus een constante neerregulatie van het gen bewerkstelligen. De Ttrap shRNAmir benadering leek veelbelovend, gezien injectie van twee verschillende shRNA plasmiden gericht tegen Ttrap leidde tot vroege emb ryonale letaliteit. Wanneer echter de correcte controle experimenten wer den uitgevoerd, werd duidelijk dat de geobserveerde defecten niet te wij ten waren aan neerregulatie van Ttrap, maar eerder een aspecifiek effect waren. Uiteindelijk blijft gen targeting de meest betrouwbare manier om een mut ante muis te genereren gezien men het targeting construct op dergelijke wijze kan genereren dat de uitschakeling van het gen gegarandeerd is. Ho moloog gerecombineerde ES cellijnen werden gegenereerd met het bestaande conditionele targeting construct, die dan op hun beurt gebruikt werden voor morula aggregatie. Verschillende chimere muizen werden gegenereerd en gaven ook kiembaan transmissie. Door deze muizen met de algemene dele ter muis EIIa-Cre te kruisen, werden homozygote Ttrap knock-out muizen g egenereerd. In tegenstelling tot de vroege embryonale letaliteit geobser veerd in de zebravis, zijn de Ttrap homozygote mutanten levensvatbaar en fertiel, hoewel ze duidelijk geen wildtype Ttrap mRNA meer produceren. De homozygote muizen vertonen geen grote uitwendige def ecten, maar moeten wel nog onderworpen worden aan een gedetailleerde ana lyse. Gezien TTRAP geïdentificeerd was als onderdeel van de TNF signalis atie cascade, betrokken in inflammatie en immuun respons, zal het uiters t interessant zijn om na te gaan of de Ttrap mutante muizen na uitlokken van bepaalde immuun responsen enig fenotype zullen vertonen. Om de biochemische functie(s) van TTRAP in in vitro celcultuur te karakt eriseren hebben we zijn mogelijke interacties en subcellulaire lokalisat ie in de cel onderzocht. TTRAP interageert zeer duidelijk met TRAF2 en T RAF6 en vertoont na overexpressie in sommige cellen ook co-lokalisatie m et deze proteïnen in vesikel-achtige structuren. Om de identiteit van de ze vesikel structuren te achterhalen, werd merker analyse uitgevoerd met verschillende merkers voor de endocytische routes. Endocytose is gekend als een bijkomend niveau van signaal transductie regulatie. Er we rd echter geen co-lokalisatie geobserveerd tussen TRAF2 en TRAF6 en de e ndocytische merkers. TTRAP interageert ook met verschillende Smad proteï nen en co-lokaliseert met Smad6 en Smad7 in de kern. TTRAP zelf komt voo ral tot expressie in de kern, en meer intens in PML nucleaire lichamen. Dit was al gerapporteerd in andere publicaties, wat een mogelijks nuclea ire functie voor TTRAP favoriseert. Hoewel TTRAP in verschillende screen ings als interactie-partner werd geïdentificeerd, werd tot nu toe geen e chte functie voor TTRAP ontdekt. We hopen dat de beschikbare Ttrap knock -out muizen nuttig zullen zijn voor de verdere karakterisatie van zijn r ol, niet alleen in vivo als mogelijk model voor ziektes, maar ook voor v erdere biochemische analyses in Ttrap mutante celculturen. Op het einde van deze thesis bespreken we de mogelijke scenario’s voor het gebruik van deze muizen in het veld van DNA herstel en proteasoom functie, mogelijks in tumorvorming en neur odegeneratie.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Molecular Biology (Celgen) (-)

Files in This Item:
File Status SizeFormat
PhD manuscript Liesbeth Vermeire 260110.pdf Published 4798KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.