ITEM METADATA RECORD
Title: Functional and structural analysis of glycoside hydrolase family 8, 10 and 11 xylanases with focus on Bacillus subtilis xylanase A
Other Titles: Functionele en structurele analyse van glycoside hydrolase familie 8, 10 en 11 xylanasen met focus op Bacillus subtilis xylanase A
Authors: Pollet, Annick
Issue Date: 19-Jan-2010
Abstract: Functionele en structurele analyse van glycoside hydrolase familie 8, 10 en 11 xylanasen met focus op Bacillus subtilis xylanase A Xylanasen zijn glycoside hydrolasen die een sleutelrol spelen in de afbr aak van heteroxylanen, een structureel heterogene groep van polysacharid en die deel uitmaken van de plantencelwand. In de natuur komen verscheid ene xylanasen voor met een verschillende structuur, katalytisch mechanis me, fysicochemische eigenschappen en substraatspecificiteit. Dit laatste wordt gedefinieerd als de voorkeur van xylanasen om heteroxylanen met e en verschillende substitutiegraad en -patroon en polymerisatiegraad te h ydrolyseren. De meeste xylanasen behoren tot glycoside hydrolase familie s (GH) 5, 8, 10 of 11. GH10 en GH11 xylanasen worden vaak gebruikt om de procescondities, de efficiëntie van het proces en/of de kwaliteit van e indproducten te verbeteren in verschillende biotechnologische processen zoals de broodbereiding, de productie van veevoeder en het bleken van ce llulosepulp in de papierbereiding. Het is in deze context dat er voortdu rend gezocht wordt naar nieuwe xylanasen met optimale eigenschappen voor een bepaald proces. Biochemische karakterisering van xylanasen in combi natie met inzicht in hun structurele eigenschappen is daarom onontbeerli jk. Het doel van dit doctoraatsonderzoek was de substraatspecificiteit v an welbepaalde xylanasen van GH8, GH10 en GH11 te bestuderen en inzicht te verwerven in de relatie tussen hun enzymatische eigenschappen en 3D-s tructuur, waarbij de nadruk gelegd werd op het GH11 Bacillus sub tilis xylanase A. Het hydrolysegedrag van drie GH8 xylanasen werd onderzocht door het bepa len van enzymkinetiek en hydrolyseproducten van xylo-oligosachariden (XO S) en complexere heteroxylanen. Ondanks hun gelijkaardige 3D-structuur v ertoonden de GH8 xylanasen uiteenlopende substraatspecificiteiten. rXyn8 , een GH8 endo-xylanase gecodeerd door een gen gekloneerd uit een genomi sche DNA-bank, vormt selectief xylotriose uit zijn substraten. Een GH8 e ndo-xylanase van Pseudoalteromonas haloplanktis verkiest de a fbraak van substraten met een hoge polymerisatiegraad en ondervindt ster ke hinder van arabinose substituenten op de xylanhoofdketen. Het exo-oli goxylanase van Bifidobacterium adolescentis, daarentegen, spl itst exclusief xylose af van kleine XOS. Vergelijking van de 3D-structur en van de GH8 xylanasen toonde aan dat er subtiele structurele verschill en zijn in hun actieve plaatsen. De actieve plaats van P. halopl anktis xylanase is zeer toegankelijk, in tegenstelling tot de afgeslo ten actieve plaats van het exo-oligoxylanase en de halfopen actieve plaa ts van rXyn8 die gedeeltelijk geblokkeerd is aan zowel de niet-reduceren de als de reducerende zijde. Deze verschillen verklaren het uiteenlopend e hydrolysegedrag van de geteste xylanasen. Omwille van hun interessante eigenschappen kunnen deze GH8 xylanasen potentieel gebruikt worden in a llerhande biotechnologische toepassingen. Twee GH10 en twee GH11 xylanasen die geproduceerd worden door Fu sarium graminearum, een fytopathogeen voor graangewassen, hebben vers chillende functionele stabiliteiten en substraatspecificiteiten en zijn gevoelig aan verschillende inhibitoren. GH10 FgXylC en FgXylD zijn optim aal actief in een groter pH-bereik dan GH11 FgXylA en FgXylB. Vooral FgX ylC is uitzonderlijk pH-stabiel. Zelfs na incubatie bij pH 1.0 of 13.0 v erloor dit xylanase slechts een klein deel van zijn activiteit. Daarnaas t kunnen FgXylC en FgXylD kleinere XOS vormen en afbreken dan de GH11 xy lanasen. FgXylC en FgXylD worden geïnhibeerd door XIP (‘xylanase inhibit ing protein’), in tegenstelling tot FgXylA en FgXylB die gevoelig zijn a an TAXI (‘Triticum aestivum xylanase inhibitor’). De samenwerking tussen de verschillende xylanasen van F. graminearum draagt waarschijnli jk bij tot de efficiënte afbraak van heteroxylanen in de plantencelwand en op die manier tot de infectie van de plant door de schimmel. Hoewel de meeste xylanasen afkomstig zijn van bacteriën of schimmels, wo rden xylanasen ook aangemaakt door planten. In deze studie werd aangetoo nd dat een GH10 xylanase dat tot expressie wordt gebracht in gekiemde ge rst, HvX-I, een veelzijdig enzym is dat de capaciteit heeft om kleine XO S en zelfs xylose vrij te zetten uit substraten met een hoge en lage pol ymerisatie- en substitutiegraad. De typische substraatspecificiteit van HvX-I zorgt ervoor dat dit enzym een rol kan spelen in de afbraak van ma teriaal in de plantencelwand tijdens de kieming.In het tweede deel van d eze studie werd GH11 BsXynA bestudeerd, een industrieel belangrijk enzym met toepassing in de broodbereiding. Het belang van individuele aminozu ren voor de activiteit, het binden van vertakte substraten en het hydrol ysegedrag van BsXynA werd onderzocht door plaatsgerichte mutagenese van zowel de actieve plaats als de ‘duimregio’. Door vergelijking van het hy drolysegedrag van het wild type xylanase en de mutanten konden aminozure n geïdentificeerd worden die belangrijk zijn voor de specificiteit van B sXynA. Aminozuren in de +2 subsite van BsXynA zijn betrokken bij de bind ing van vertakte substraten. Mutagenese van de +3 subsite van BsXynA cre ëerde een mutant die in staat is om een bredere waaier aan hydrolyseprod ucten vrij te zetten dan het wild type xylanase. De bijdrage van de +3 s ubsite tot de substraatspecificiteit van BsXynA werd verder onderzocht d oor het in kaart brengen van de substraatbindingsplaats van het wild typ e xylanase en de mutant. Hiervoor werd gebruik gemaakt van gelabelde XOS . Ook werd aangetoond dat de lengte van de ‘koord’ - een lange lus die g renst aan de reducerende zijde van de actieve plaats van GH11 xylanasen - een effect heeft op het hydrolysegedrag van BsXynA. Naast de actieve plaats werd ook de rol onderzocht van een lus die de vo rm heeft van een ‘duim’ in de structuur van BsXynA. Kristallografische a nalyse van de 3D-structuur van een BsXynA mutant toonde aan dat de duim een gestrekte conformatie kan aannemen, in tegenstelling tot de tot nu t oe gekende gesloten conformatie. Plaatsgerichte mutagenese van de duim e n de kinetische parameters van de mutanten toonden aan dat het muteren v an aminozuren in de duim zowel de binding als het vrijzetten van substra at uit de actieve plaats beïnvloedt. De duimregio en de dynamica ervan i s bijgevolg van cruciaal belang voor de katalytische werking van GH11 xy lanasen. Deze kennis kan gebruikt worden voor het doelgericht modificeren van BsX ynA om zijn werking in biotechnologische toepassingen te verbeteren. Samenvattend werden in dit doctoraatsonderzoek xylanasen van verschillen de oorsprong en families en met een sterk verschillende specificiteit en potentieel voor toepassingen, aangemaakt en gekarakteriseerd. De struct urele aspecten die aan de basis kunnen liggen van de substraatspecificit eit van de bestudeerde xylanasen werden onderzocht. De resultaten van de ze studie toonden aan dat zowel de reducerende zijde van de actieve plaa ts als de duim van BsXynA een cruciale rol spelen in de substraatspecifi citeit van dit enzym en creëerden zo nieuwe inzichten in de structuur-fu nctie relatie van GH11 xylanasen.
ISBN: 978-90-8826-124-4
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Centre for Food and Microbial Technology

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Pollet_2010_PhD_thesis.pdf Published 15306KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.