ITEM METADATA RECORD
Title: Secretory pathway Ca2+-transport ATPases (SPCAs):role in cytosolic Ca2+ signaling and subcellular localization
Other Titles: Secretorische Ca2+-transport ATPasen (SPCAs):rol in cytosolische Ca2+ signalen en subcellulaire lokalisering
Authors: Baron, Szilvia
Issue Date: 16-Dec-2009
Abstract: ‘Secretory pathway Ca2+-transport ATPases’ (SPCA’s) bestaan in twee isov ormen, SPCA1 en SPCA2. SPCA1 is gelokaliseerd in het Golgi apparaat en i s in alle cellen aanwezig. SPCA2 komt slechts in een beperkt aantal celt ypes voor, wat er op wijst dat deze variant een meer gespecialiseerde ma ar nog niet gekende functie heeft. Ook de subcellulaire verdeling van SP CA2 is nog niet duidelijk. Terwijl SPCA1 altijd in het Golgi apparaat ge vonden werd, is dit ook zo voor SPCA2 in epitheliale cellen van het colo n maar niet in neuronen van de hippocampus, waar het verdeeld is over kl eine vesikels verspreid over de cel. Daarom is verdere analyse nodig van de celspecifieke expressie, subcellulaire verdeling en functie van SPCA ’s, vooral van SPCA2. Omdat functionele studies meer informatie kunnen o pleveren op geïsoleerde cellen, hebben we ons beperkt tot cellijnen in c ultuur en tot vrij-levende gedifferentieerde cellen. Op basis van litera tuurgegevens en een initiële screen van verschillende celtypes hebben we uiteindelijk gefocuseerd op menselijke neutrofielen en HT29 humane colo n adenocarcinomacellen. In neutrofielen hebben we de expressie van zowel SPCA1 als SPCA2 aangeto ond. De subcellulaire verdeling van SPCA1 en SPCA2 was gelijkaardig. Bei den werden aangetroffen aan de periferie van de cel en tussen de lobben van de kern. De SERCA2b en SERCA3 Ca2+ pompen die merkers zijn voor het endoplasmatisch reticulum (ER), evenals het ER-specifieke Ca2+-bindende proteïne calreticulin waren eveneens aan de celperiferie en tussen de ke rnlobben gesitueerd. Bovendien vertoonden verschillende Golgi merkers ee n gelijkaardige verdeling in neutrofielen. Deze resultaten zijn in overe enstemming met de hypothese dat deze kort levende en sterk gespecialisee rde cellen na differentiatie niet langer strict gescheiden ER en Golgi b evatten maar de functie van beide organellen verenigen in zowel perifere als centraal gelegen compartimenten. In HT29 cellen vonden we eveneens zowel SPCA1 als SPCA2. Zoals neutrofie len brengen HT29 cellen naast SERCA2b ook SERCA3 tot expressie. Beide SP CA’s hadden een Golgi verdeling, zoals in cellen in colonweefsel, terwij l SERCA2b en SERCA3 het typische ER patroon vertoonden. In het beperkte aantal celtypes dat tot nog toe onderzocht werd is de Ca 2+ die door IP3-producerende agonisten uit het Golgi vrijgezet wordt afk omstig van dat deel van het Golgi dat door SERCA activiteit opgevuld wor dt met Ca2+. We hebben onderzocht of neutrofielen en HT29 cellen een SER CA-onafhankelijke Ca2+ stapelplaats zouden bezitten die door agonisten k an vrijgezet worden en of deze Ca2+ een rol zou kunnen vervullen in cyto solaire Ca2+ signalen. We maakten vooral gebruik van thapsigargine (TG), dat bij lage concentraties een SERCA-specifieke inhibitor is. De agonisten ATP en neurotensin mobiliseerden Ca2+ alleen uit SERCA-afha nkelijke intracellulaire Ca2+ stapelplaatsen in HT29 cellen. In neutrofi elen vonden we echter agonist-geïnduceerde Ca2+ vrijzetting wanneer de c ellen door een chemoattractant gestimuleerd werd. Omdat deze Ca2+ vrijze tting verdwijnt bij een hogere dosis TG die ook SPCA’s inhibeert, is dez e stapelplaats waarschijnlijk SPCA afhankelijk. We hebben dan verder onderzoek gedaan naar het functionele belang van de SERCA-afhankelijke en SERCA-onafhankelijke Ca2+ vrijzetting in neutrofi elen. Neutrofielen werden onderworpen aan verschillende experimentele co ndities om het effect na te gaan van intracellulaire Ca2+ veranderingen op vormveranderingen en migratie van de cellen. Op basis van onze result aten stellen we voor dat de Ca2+ die nodig is voor de activatie en reorg anisatie van het actine cytoskelet die de cel in staat stelt zich te ver plaatsen vooral afkomstig is van SERCA-afhankelijke compartimenten. De s tapelplaatsen die door SPCA’s van Ca2+ voorzien worden dragen bij tot de finale vorming van de protrusies. In het laatste deel van onze studie hebben we onderzoek gedaan naar spec ifieke membraandomeinen waarin SPCA1 zou kunnen gelokaliseerd zijn in HT 29 cellen. De membranen van het Golgi vertegenwoordigen een transitie tu ssen de zeer vloeibare cholesterol-arme membranen van het ER en de chole sterol-rijke plasma membraan. Het verschil in samenstelling van de membr anen van deze organellen zou een effect kunnen hebben op de lokalisatie en op de functie van de Ca2+-transport ATPasen die er in voorkomen. Extractie met Triton X-100 en scheiding op Nycodenz densiteitsgradiënten werden gebruikt om microdomeinen uit de membranen van HT29 cellen te is oleren die resistent zijn aan detergent extractie. Deze microdomeinen wo rden ‘rafts’ genoemd en zijn aangerijkt in cholesterol en in specifieke proteïnen. SPCA1 van het Golgi werd in de detergent-resistente fracties terug gevonden, samen met cholesterol en met het raft merker proteïne fl otillin-2, terwijl het ER proteïne SERCA3 in de detergent oplosbare frac ties voorkwam. Als bijkomende evidentie voor de lokalisatie van SPCA1 in rafts werd de structuur van deze domeinen verstoord door middel van depletie van chole sterol. Wanneer de detergent extractie voorafgegaan werd door cholestero l depletie van de membranen, herverdeelden flotillin-2 en SPCA1 naar de detergent-oplosbare fracties, terwijl deze behandeling geen effect had o p de verdeling van SERCA3. Daarnaast werd Triton X-100 extractie ook toe gepast op levende cellen die fluorescent gemarkeerde Ca2+ pompen of fluo rescente merkers van raft en niet-raft domeinen tot expressie brachten, en werd het tijdsverloop van solubilisatie gevolgd door confocale micros copie. SPCA1d-N-GFP was resistent tegen detergent extractie in levende C OS-1 en HT29 cellen, terwijl SERCA2b fluorescentie sneller verdween, in overeenstemming met de exclusie van SERCA’s uit raft domeinen. Daarnaast hebben we ook vastgesteld dat de Ca2+-gestimuleerde ATPase act iviteit van SPCA1d in COS-1 cellen geïnhibeerd wordt door cholesterol de pletie. We besluiten uit de detergent extractie van geïsoleerde membranen en van levende cellen dat het Golgi-specifieke SPCA1 een raft-geassocieerd pro teïne is in HT29 cellen, en dat de cholesterol-rijke omgeving in deze mi crodomeinen ook belangrijk is voor de normale pompactiviteit van dit tra nsport enzyme.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Cellular Transport Systems

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Szilvia+Baron_Doctoral+thesis.pdf Accepted 2641KbAdobe PDFView/Open

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.