ITEM METADATA RECORD
Title: Novel vaccination strategies to protect birds against Asian HP H5N1 influenza viruses
Other Titles: Nieuwe vaccinatie strategieën ter bescherming van vogels tegen hoog pathogene Aziatische H5N1 influenza virussen
Authors: Steensels, Mieke; M9815082
Issue Date: 22-Dec-2009
Abstract: Hoog pathogene Aziatische (AsHP) H5N1 virussen ciruculeren in Azië sinds 1997, en werden enzoötisch in 8 Aziatische landen sinds 2004. De verspr eiding van deze destructieve pluimveeziekte naar zuid-oost Azië, het mid den oosten, Europa en Afrika kon niet voorkomen worden door de aanwendin g van de klassieke inperkingsmaatregelen. De verspreiding van het virus kon deels gekoppeld worden aan vogelmigratie, aangezien de AsHP H5N1 vir ussen in staat zijn watervogels, zoals eenden en ganzen, te infecteren. De combinatie van de hoge virulentie, de enzoötische situatie die ontsto nd in delen van Azië en Afrika, en de verspreiding door zowel gedomestic eerde als wilde vogels geïnfecteerd met het AsHP H5N1 virus, maakte de b eschikbaarheid van efficiënte vaccinatiestrategieën een noodzaak. Hierbi j moet vaccinatie gezien worden als een extra controlemaatregel die geco mbineerd dient te worden met grondige bewaking, bioveiligheid, transport beperkingen, het opvolgen van infectie in gevaccineerde groepen en ander e controlemaatregelen. Om het ultieme doel, het stoppen van transmissie en uiteindelijk de volledige uitroeiing, te bereiken, zijn al deze maatr egelen noodzakelijk. Het doel van deze thesis was de kennis omtrent Aviaire influenza (AI)-va ccinatie tegen AsHP H5N1 virussen uit te breiden. In elke studie werd ee n bepaald gebrek aan kennis bestudeerd door gebruik te maken van verschi llende AsHP H5N1 virussen, verschillende vaccins en verschillende gasthe ren. De efficiëntie van een aantal klassieke geïnactiveerde en nieuwe ge neratie recombinante vaccins tegen AsHP H5N1 infectie werd onderzocht. Voor het evalueren van een vaccin werden een aantal criteria gedefinieer d, maar deze zijn slechts beperkt gestandaardiseerd. Bijgevolg blijft de meest correcte wijze voor vaccin-evaluatie een dierinfectie studie. Alv orens een infectiemodel te ontwikkelen werd een grondige genetische stud ie uitgevoerd op de in ons laboratorium geïsoleerde A/crested eagle/Belg ium/01/2004 clade 1 stam. De volledige genoomsequentie van de arendstam gaf duidelijk zijn Thaise oorsprong weer. De gemeenschappelijke oorspron g van onze clade 1 en het in Hongarije uit gedomesticeerde eenden geïsol eerde clade 2.2 H5N1 virus werd duidelijk wanneer een alignering van bei de sequenties werd uitgevoerd. Voor de ontwikkeling van een infectiemodel werd een grondige virulenties tudie uitgevoerd. Analyse van het dosiseffect en de toedieningswijze wer d uitgevoerd voor zowel de clade 1 AsHP H5N1 stam als een onafhankelijk hoog pathogeen (HP) H7N7 virus geïsoleerd uit kippen in België in 2003. Hieruit werd besloten dat een dosis van minstens 106 EID50 (50% Ei-Infec tieuse Dosis) nodig is om een letale infectie te veroorzaken in kippen v an verschillende leeftijden. De oculonasale weg was minder fataal, in ve rgelijking met intramusculaire infectie, maar werd verkozen omdat dit ee n betere simulatie is van de natuurlijke infectieweg onder laboratorium- condities. Vervolgens werden de gekozen dosis en infectieweg bevestigd m et een tweede AsHP H5N1 virus, een clade 2.2, om de relevantie van deze keuzes aan te tonen voor infectiestudies met andere AsHP H5N1 virussen. Het gastheerbereik werd bestudeerd door verschillende typen eenden en ki ppen te infecteren. De pathogeniciteit van de clade 1 AsHP H5N1 stam voo r kippen bleek voornamelijk bepaald te zijn door dosis en inoculatieweg. Door de hoge pathogeniciteit van beide AsHP H5N1 virussen voor pluimvee kwam het belang van leeftijd en ras minder duidelijk tot uiting. Voor a ndere hoog pathogene aviaire influenza (HPAI) virussen, zoals ons HP H7N 7 virus, met een iets lagere virulentie bij kippen, kwam het belang van leeftijd en ras voor kippen wel duidelijk naar voren. Voor eenden zijn d e leeftijd en het ras bepalend voor de gevoeligheid aan AsHP H5N1. Dankzij deze genetische en experimentele karakterisatie van het virus we rd een goed gefundeerd modelsysteem ontwikkeld dat gebruikt kan worden v oor AsHP H5N1 virussen in toekomstige pathogeniciteits, adaptatie en vac cinatie studies. Voor de evaluatie van vaccin-efficiëntie dient ten eerste het effect op klinische symptomen en mortaliteit te worden bepaald. Bijkomende informa tie kan worden bekomen door het opvolgen van de serologische respons (ho moloog en heteroloog) en de vermindering van virale excretie. Deze bijko mstige indicatoren zijn vooral belangrijk wanneer vaccinatie-efficiëntie moet worden nagegaan bij een gastheer met een beperkte klinische manife statie na infectie, zoals voor Pekin eenden werd aangetoond tijdens het opstellen van het infectiemodel. De vermindering of eliminatie van viral e excretie is van belang voor het stoppen van de overdracht en de uitein delijke uitroeiing van het virus. Voor het opvolgen van virale excretie werd in huis een gevoelige real time retro-transcriptie polymerase keten reactie ((RT)²-PCR) techniek ontwikkeld voor grote aantallen swabstalen . Vaccinatie tegen Aviaire influenza (AI) wordt vooral toegepast in geval van een uitbraak of in een enzootische situatie. Het is wenselijk pluimv ee zo vroeg mogelijk te vaccineren tegen AI. Vaccinatie op dag 1 laat ee n uniformering en automatisering toe in de uitkippingsbedrijven, wat de controle vereenvoudigt en het rondtrekken van vaccinatieteams onnodig ma akt. Vaccinatie op dag 1 laat ook toe een aantal mogelijke immunosuppres sieve infecties in het veld te omzeilen die van belang kunnen zijn wanne er wordt gevaccineerd op een latere leeftijd. Een eerste gebrek aan kennis betreft de vaccinatie-efficiëntie in aanwez igheid van maternale antilichamen (MDA, ‘Maternally Derived Antibodies”) bij jonge kuikens, als gevolg van systematiche vaccinatie, bijvoorbeeld in enzoötische regio’s. De MDA kan een bepaalde graad van bescherming b ieden maar kan ook interfereren met vaccinatie. In een eerste studie werd slechts een minimale bescherming van klassieke geïnactiveerde vaccins in vetkuikens, gevaccineerd op 1 dag leeftijd, a angetoond, onafhankelijk van de aanwezigheid van AI-MDA. Dit is het gevo lg van het onrijpe immuunsysteem op deze leeftijd. Een eerste-vaccinatie op 10 dagen leeftijd, met een klassiek geïnactiveerd vaccin, in de aanw ezigheid van AI-MDA gaf echter wel bemoedigende resultaten. Een dubbele vaccinatie blijft echter aan te raden om een optimale bescherming te bek omen, zeker in regio’s met een hoge infectiedruk. Voor een zo vroeg mogelijke vaccinatie, dag 1 of in ovo (in het geëmb ryoneerde ei), vormen de levende recombinante vaccins een oplossing a angezien zij een maturatie van de immuunrespons kunnen induceren op jong e leeftijd en bovendien zich dikwijls beter lenen voor de ontwikkeling v an massavaccinatie-strategieën dan geïnactiveerde vaccins. De efficiënti e van deze recombinante vaccins in aanwezigheid van MDA is ook weinig be kend. Twee recombinante fowlpox-H5 (rFP-H5) vaccins, met een hemagglutin ine (HA) met verschillende verwantschap ten opzicht van de AsHP H5N1 vir ussen, werden getest voor hun efficiëntie tegen een AsHP H5N1 infectie i n de aanwezigheid van AI en vector-MDA. In onze handen werd een signifik ante negatieve interferentie gedetecteerd tussen de aanwezigheid van de AI en vector MDA en de bescherming bekomen door vaccinatie in afwezighei d van deze MDA. Via de serologische gegevens werd een beter inzicht bekomen in de immuun respons opgewekt door de rFP-vaccins in kippen. M2-ELISA-resultaten toon den aan dat kippen zonder MDA goed beschermd worden tegen infectie door de rFP-vaccins wat werd bevestigd door de excretie gegevens. Bovendien w erd het belang van HA-homologie tussen het geïnsereerde gen in het recom binant vaccin en de infectie-stam een betere bescherming tot gevolg heef t, opnieuw aan de hand van M2-ELISA op sera en (RT)²-PCR-analyses op clo acale en orofaryngale uitstrijkjes. De negatieve invloed van MDA op de bescherming bekomen door vaccinatie v oor zowel geïnactiveerde als recombinante vaccins kwam duidelijk tot uit ing in de analyse van klinische symptomen, virale excretie en serologisc he reactie in vergelijking met dieren zonder MDA. Zelfs een boost-vaccin atie, met een klassiek geïnactiveerd vaccin op latere leeftijd, kon de i nhibitie van vaccin-geïnduceerde bescherming in aanwezigheid van MDA nie t opheffen. De waargenomen inhibitie lijkt direct gecorreleerd te zijn m et de hoeveelheid residueel MDA op het moment van vaccinatie. Bijgevolg kan de hoeveelheid AI-MDA op dag 1 nuttig zijn om de ideale leeftijd voo r vaccinatie te bepalen. Op het moment dat dit doctoraatsonderzoek startte, was de kennis omtrent AI-vaccinatie in eenden erg beperkt. De efficiëntie van klassieke volle dig virus geïnactiveerde vaccins werd wel al aangetoond in kippen terwij l er voor eenden maar enkele vaccinatiestudies werden gerapporteerd. Om dit kennishiaat in te vullen maakten we een vergelijking van de effic iëntie van een dubbele homologe vaccinatie met een klassiek geïnactiveer d vaccin ten opzichte van een rFP-H5 vaccin in Muscovy eenden. Een belangrijke vermindering van de klinische symptomen en virale excretie werden bekomen in de erg gevoelige Muscovy eenden met zowel het klassiek e geïnactiveerde als het nieuwe fowlpox-vector vaccin. In onze handen le verde de dubbele vaccinatie met het geïnactiveerde vaccin een net iets b etere bescherming op dan het rFP-H5-vaccin. Het belang van HA-homologie tussen de veldstam en het recombinant gen in de vector werd reeds beschreven in vroegere studies op specifief pathog een vrije (SPF)-kippen. Om het voordeel van dag-oude vaccinatie van de n ieuwe generatie vaccins te gebruiken, werd een meer genetisch verwant rF P-H5 vaccin getest in dag-oude SPF Pekin eenden. Verschillende vaccinati e schema’s werden geëvalueerd gebruik makend van het geïnactiveerde en/o f het rFP-H5 vaccin. Een volledige bescherming tegen klinische symptomen en virale excretie werd bekomen met de verschillende vaccin-combinaties . Via serologie werd aangetoond dat de breedste immuunrespons en de laag ste inductie van antilichaamproductie na infectie, werd waargenomen in d e groep waarvan het immuunsysteem werd geprimed met de rFP-H5 gevold doo r een boost met het geïnactiveerd vaccin. In onze handen induceerde de “ prime-boost” strategie een optimale immuniteit tegen AsHP H5N1-infectie gecombineerd met een minimale virale replicatie in eenden. Ter conclusie, een goed gevalideerd infectiemodel is onmisbaar voor het evalueren van vaccinatie-efficiëntie. De keuze voor de clade 1 stam werd ondersteund door een gedetailleerde genetische en pathotypische karakte risatie. Er werd aangetoond dat de A/crested eagle/Belgium/01/2004 H5N1 stam kan fungeren als een vertegenwoordiger van een bredere familie viru ssen. De herhaalbaarheid van het infectie-model werd aangetoond en de na tuurlijke situatie werd zo goed mogelijk benaderd onder laboratorium oms tandigheden. Voor het opvolgen van de immuunrespons werd naast de beschikbare hemaggl utinatie inhibitie (HI)-test in huis een test ontwikkeld om geïnfecteerd e en gevaccineerde dieren van elkaar te kunnen onderscheiden (=DIVA-test ). Deze M2-ELISA (matrix proteïne 2) kan ook gebruikt worden voor de eva luatie van vaccin-efficiëntie, door indirecte detectie van virusvermenig vuldiging na infectie. Bovendien werd een hoog gevoelige moleculaire tec hniek ontwikkeld voor de opvolging van virale excretie na infectie. Een aantal belangrijke vragen omtrent AI-vaccinatie werden beantwoord do or onze vaccinatie-infectie-studies. In afwezigheid van MDA bleken de ni euwe generatie levende recombinante vaccins erg succesvol te zijn bij to ediening op dag 1. In geval van continue vaccinatie en het ontstaan van MDA werd een negatieve invloed van de MDA op vaccinatie-efficiëntie waar genomen. Door het bepalen van het ideale moment voor een boost-vaccinati e, op basis van de hoeveelheid residueel MDA, kan deze negatieve interfe rentie verminderd worden. Ook de kennis over AI-vaccinatie bij eenden werd aangevuld. Een prime-bo ost strategie kwam naar voren als een veelbelovende strategie voor de in ductie van bescherming in watervogels tegen een AsHP H5N1 infectie. De b rede immuunrespons geïnduceerd door de prime-boost vaccinatie induceerde zowel klinische bescherming als een significante reductie van virale ex cretie. Uit onze resultaten stellen wij een prime-boost vaccinatie voor met een recombinant vaccin, met een HA-gen dat nauw verwant is met de circuleren de stam, dat niet al te gevoelig is voor MDA gevolgd door een breed-spec trum olie-in-water geïnactiveerd vaccin. Een dergelijke strategie heeft een goed potentieel om in de toekomst gebruikt te worden voor AI-vaccina tie.
Description: The study presented in this work was performed at the Veterinary and Agrochemical Research institute, VAR, Ukkel, Belgium. The work was supported by a research grant of the federal government, DG4-research.
Table of Contents: TABLE OF CONTENTS

Dankwoord


Samenvatting - Summary I


List of abbreviations XI


Table of contents XV


Introduction 1

1 General introduction to the influenza A world 2
1.1 Etiology
1.2 Nomenclature
1.3 Infection-replication cycle
1.4 Ecology and Epidemiology
1.5 Role of HA and NA in pathogenicity and antigenicity of AI
2 The Asian highly pathogenic avian influenza H5N1 epizootic 13
2.1 Past HPAI outbreaks
2.2 The Asian H5N1 epizootic (1996-now)
3 Vaccination against avian influenza in birds 18
3.1 AI prophylaxis and legislation
3.2 Protective immune response against influenza A infection
3.3 Vaccination against AI
3.3.1 Dead vaccines
3.3.2 Live vaccines
3.4. Efficacy of AI vaccines in other bird species
3.5 AI Vaccination Strategies
3.6 DIVA strategies


Aims of the study 31


Material and Methods 33

1 Viral strains used 34
2 Animal Studies 34
3 Statistical analysis 34
4 Swab-sampling to monitor viral excretion 35
5 Preparation of a primary CEF- culture 35
6 Virology 35
6.1 Hemagglutination (HA)-test
6.2 Virus Isolation (VI) and Titration
6.3 Intravenous pathogenicity index (IVPI)
7 Molecular biology 38
7.1 RNA extraction
7.2 (RT)²-PCR
7.3 Genetic characterisation
8 Serology 44
8.1 HI-test
8.2 Fowlpox ELISA
8.3 M2-ELISA
9 Buffers and Solutions 46


CHAPTER I: Defining a challenge model for the “A/Crested_Eagle/Belgium/01/2004”-isolate 49

I.1 Introduction 50
I.2 Experimental design 50
I.2.1 Challenge virus
I.2.2 Experimental setup
I.3 Results 51
I.3.1 Genetic characterisation
I.3.2 Pathogenic Characterisation
I.4 Discussion 56


CHAPTER II: Development of a universal endogenously controlled and quantitative (RT)²-PCR for Asian HPAI H5N1 57

II.1 Introduction 58
II.2 Experimental design 59
II.2.1 Challenge virus
II.2.2 Experimental setup
II.3 Results 59
II.3.1 Quantification of (RT)²-PCR inhibition by cloacal and oropharyngeal swabs.
II.3.2 Optimization of the influenza (RT)²-PCR protocol for samples containing RT-PCR inhibitors
II.3.3 Development of a universal avian endogenous internal control
II.3.4 Validation of β-Act as normaliser control for virus quantification
II.3.5 Validation of internally controlled Taq-boosted (RT)²-PCR influenza detection protocol
II.3.6 Multiplex (RT)²-PCR influenza M-gene and β-Act
II.4 Discussion 66
CHAPTER III: The influence of passive humoral immunity on vaccination efficacy for classical and new generation recombinant vaccines against Asian HPAI H5N1 69

III.1 Introduction 70
III.2 Experimental design 71
III.2.1 Challenge virus
III.2.2 Vaccines
III.2.3 Experimental setup
III.2.3.1 Protection afforded by inactivated vaccines in broilers and their interference with MDA
III.2.3.2 Protection afforded by recombinant fowlpox vaccines and their interference with MDA
III.2.3.2.1 Interference of MDA with the induction of protection by two fowlpox-vectored H5-vaccines
III.2.3.2.2 Interference of MDA with the induction of protection by different vaccination strategies
III.3 Results 74
III.3.1 Interference of MDA with the induction of protection by inactivated vaccines in broilers
III.3.1.1 Vaccination of broilers with a classical H5N2 inactivated vaccine
III.3.1.2 Vaccination of day-old broilers with classical inactivated vaccines
III.3.2 Interference of MDA with the induction of protection by recombinant fowlpox-H5 vaccines
III.3.2.1 Development of a fowlpox-ELISA to measure the anti-fowlpox passive antibodies
III.3.2.2 Interference of MDA with the induction of protection by two fowlpox-vectored H5-vaccines
III.3.2.3 Interference of MDA with the induction of protection by different vaccination strategies
III.4 Discussion 91
III.4.1 Interference of anti-H5-MDA with the induction of protection by classical inactivated vaccines
III.4.1.1 Passive protection afforded by MDA
IIII.4.1.2 Active protection in the presence of MDA
III.4.2 Interference of anti-H5- and anti-vFP-MDA with the induction of protection by new generation fowlpox vaccines


CHAPTER IV: Efficacy of an inactivated and a fowlpox-vectored vaccine in Muscovy Ducks against an Asian HPAI H5N1 Challenge 97

IV.1 Introduction 98
IV.2 Experimental design 99
IV.2.1 Challenge virus
IV.2.2 Vaccines
IV.2.3 Experimental setup
IV.3 Results 100
IV.4 Discussion 104


CHAPTER V: Prime-boost vaccination with a fowlpox vectored and inactivated AI vaccine in Pekin ducks 107

V.1 Introduction 108
V.2 Experimental design 109
V.2.1 Challenge virus
V.2.2 Vaccines
V.2.3 Experimental setup
V.2.3.1 Challenge study
V.2.3.2 Immunogenicity study
V.3 Results 111
V.3.1 Challenge study
V.3.2 Immunogenicity study
V.4 Discussion 115


CHAPTER VI: General discussion and Future perspectives 119

VI.1 Vaccination against avian influenza and its limitations 120
VI.2 Discussion 122
VI.3 Conclusion 127
VI.4 Gaps and future perspectives 128


REFERENCES 129


LIST OF PUBLICATIONS 149
ISBN: 978-90-8826-118-3
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Division of Gene Technology (-)

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Doctoraat Steensels Mieke_Finale versie voor Drukker.pdf Published 3474KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.