ITEM METADATA RECORD
Title: Activity regulation and function of protein Ser/Thr kinase Melk
Other Titles: Activiteitsregeling en functie van proteïne Ser/Thr kinase Melk
Authors: Vancauwenbergh, Sadia; M0316358
Issue Date: 4-Nov-2009
Abstract: De reversibele fosforylering van proteïnen heeft een invloed op bijna al le aspecten in het bestaan van een cel. De ontregeling van het precieze evenwicht tussen de werking van kinasen en fosfatasen leidt vaak tot het ontstaan van ziekten bij de mens, waaronder kanker. Daarom is het een g rote uitdaging voor de biomedische wetenschappen om de precieze werking van deze moleculen te onderzoeken en de betrokken signaaltransductiewege n te bepalen. In deze thesis hebben we de activiteitsregeling en de func tie van het serine/threonine proteïne kinase Melk nader onderzocht. Melk is een wijdverspreid eiwit dat betrokken is bij verschillende cellulair e processen zoals de zelfhernieuwing van stamcellen, de voortgang van de celcyclus, pre-mRNA splicing, embryonale ontwikkeling en de eerste fase n van de hematopoiese. Daarnaast is Melk ook betrokken bij de ontwikkeli ng van kanker. Zo is de overexpressie van Melk in allerhande kankers ger apporteerd en zorgt zijn knockdown voor een verminderde proliferatie en groei van tumoren (Gray et al. 2005). Daarom lijkt Melk dus een zeer interessant doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. In het eerste deel van mijn thesis hebben we de substraatspecificiteit e n de activiteitsregeling van het proteïne kinase Melk onderzocht. Vooree rst hebben we aangetoond dat Melk een eerder brede substraatspecificitei t heeft en dat er geen specifieke vereisten zijn voor de aminozuren die de fosforyleringsplaatsen omgeven. Daarnaast hebben we bestudeerd welke determinanten, die gelegen zijn in de structuur van Melk, de kinase acti viteit beïnvloeden. Het kleinste fragment dat nog katalytische activitei t vertoont, omvatte het N-terminale katalytische domein tesamen met het flankerende ubiquitine-geassocieerde domein. Het C-terminale TP-dipeptid e rijke gebied daarentegen functioneerde dan weer als een auto-inhibitor isch domein. Daarnaast hebben we in totaal 16 autofosforyleringssites te ruggevonden, waaronder serines, threonines en een tyrosine residue en he bben we aangetoond dat de fosforylering van twee van deze sites, nl. thr eonine 167 en serine 171, vereist zijn voor de activiteit van Melk. Tot slot hebben we onderzocht of de activiteit van Melk beïnvloedt wordt doo r exogene factoren. Dit leidde tot de observatie dat Melk calcium bindt en dat zijn katalytische activiteit nagenoeg volledig geïnhibeerd wordt door fysiologische calciumconcentraties. Verder hebben we ook gevonden d at de activiteit van Melk afhankelijk is van de aanwezigheid van reducer ende agentia, via een mechanisme dat de reductie van tenminste twee cyst eïnes vereist. De bovenstaande gegevens werden vervolgens allen bevestig d in zoogdiercellen. In het tweede deel van de thesis, hebben we een grootschalige screening gedaan om het kinase te identificeren dat de interactie van Melk met Nip p1 controleert via fosforylering van threonine 478 van Melk. Met behulp van een gist deletie bibliotheek screening hebben we elf kandidaat kinas en geïdentificeerd. Vervolgens hebben we de humane homologen hiervan geï dentificeerd. Op basis van de gelijkenis van de geprefereerde substraats equentie met de sequentie die het fosforyleerbare residu threonine 478 v an Melk omgeeft, hebben we twee kinasen geselecteerd, namelijk Cdk5 en C dk12 als kandidaat Melk kinasen. Hoewel beide kinasen Melk in vitro f osforyleren, hebben we enkel voor Cdk12 een rol kunnen aantonen in de in vivo vorming van het Melk-Nipp1 complex. Daarnaast hebben we gezien dat Nipp1 een substraat is voor Melk in vitro en hebben we het functi onele belang van enkele fosforyleringssites aangetoond. Zo hebben we gev onden dat de fosforylering van threonine 61 van Nipp1 door Melk, de Melk -Nipp1 interactie verhinderd. In het derde deel van de thesis hebben we onderzocht of Melk, zoals zijn interactiepartner Nipp1, betrokken is in de epigenetische silencing van genen. Ten eerste hebben we aangetoond dat Melk de expressie van versch illende Nipp1-target genen controleert, waaronder ook het tumor-suppress or gen MSMB. De expressie van MSMB verandert dramatisch na de over expressie van een katalytisch inactieve of Nipp1-bindingsdeficiënte Melk mutant. Vervolgens hebben we een microarray analyse uitgevoerd na de kn ockdown van Melk in PC3 cellen en hebben we aangetoond dat Melk en Nipp1 de expressie regelen van een overlappende set van genen. Tot slot, hebb en we het mechanisme onderzocht hoe Melk genexpressie controleert en heb ben we gevonden dat Melk het histone methyltransferase Ezh2 fosforyleert , hetgeen zou kunnen bijdragen tot de regeling van diens activiteit.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Biosignaling & Therapeutics

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.