ITEM METADATA RECORD
Title: A functional genomic approach to characterize proteins involved in Drosophila immunity.
Other Titles: Een 'functional genomic' benadering om proteïnen die betrokken zijn bij immuunresponsen in Drosophila te karakteriseren.
Authors: Reumer, Ank
Issue Date: 16-Dec-2009
Abstract: Metazoa gebruiken efficiënte mechanismen om infecties af te weren. Het a angeboren immuunsysteem is het onmiddellijke en eerste-lijns verdediging smechanisme dat actief wordt nadat microbiële indringers door kiemcel-ge codeerde receptoren herkend worden, en het leidt vervolgens tot een reek s van snelle afweer reacties. Het verworven immuunsysteem, aan de andere kant, komt enkel voor bij vertebraten. Hier wordt het gecontroleerd en geassisteerd door het aangeboren immuunsysteem. Heel wat fundamentele signaalwegen die de oeroude aangeboren immuunmecha nismen reguleren, bijvoorbeeld tussen mensen en de fruitvlieg Dr osophila melanogaster, zijn evolutionair geconserveerd. Omdat <I &gt;Drosophila geen verworven signalisatie- of uitvoeringssystemen heeft , is het een belangrijk modelorganisme geworden om ‘onaangetaste’ aangeb oren immuuncascades en reacties te bestuderen. Verder kunnen drosophilis ten een beroep doen op zeer gesofisticeerde en continu verbeterende gene tische methoden om de functie van genen te achterhalen. Dit leidde tot e en dieper inzicht in zowel het aangeboren immuunsysteem van de fruitvlie g als dat van zoogdieren. Vele vragen e blijven echter onopgehelderd. Een immuunrespons wordt uitgelokt wanneer microorganismen de fysische of chemische barrières van de fruitvlieg doorbreken, en de infectie wordt vervolgens bestreden in de hemolymfe, de equivalent van het bloedplasma in zoogdieren. Het aangeboren immuunsysteem in de fruitvlieg bestaat uit een fenoloxidase reactie, een cellulaire reactie (hemocyten), een antiv iral reactie, en de NF-&#954;B afhankelijke productie van antimicrobiële peptiden, ook de humorale reactie genoemd. Verder zijn ook de JAK/STAT en de Jun kinase reactiewegen betrokken bij de afweer tegen pathogenen. Twee strategiën werden in ons labo gebruikt om de geconserveerde aangebo ren immuunsignaalwegen verder te ontrafelen in de fruitvlieg. De eerste had als doel om de humorale afweermechanismen in volwassen fruitvliegen, bestaande uit de Toll en de imd reactiewegen, verder op te helderen geb ruikmakend van een genetische overexpressie screen. Activatie van deze b eide reactiewegen als gevolg van de detectie van een pathogeen, resultee rt in de synthese en de vrijstelling van antimicrobiële peptiden in de h emolymfe. De activatie van een reactieweg na de overexpressie van een ge n kan vervolgens in vivo gevolgd worden aan de hand van ‘Gree n fluorescent protein’ reporters die specifiek de synthese van antimicro biële peptiden kenbaar maken. Helaas hebben we de belangrijkste bewijzen voor de uitvoerbaarheid van onze genetische screen niet kunnen leveren. Hierdoor werd besloten om alle voorbereidingen voor de screen, die even tueel had kunnen resulteren in de identificatie van ‘nieuwe’ componenten van de Toll en imd reactiewegen, te stoppen. In de tweede strategie gebruikte Vierstraete et al. (200 4a,b) proteomics om de onmiddellijke effecten van de aanwezigheid van zi ekteverwekkers in de larvale hemolymfe te onderzoeken. Hierbij werd geke ken naar de veranderingen in de hoeveelheid en in de identiteit van prot eïnen in de hemolymfe. Naast proteïnen waarvan geweten is dat ze een imm uunfunctie hebben in Drosophila werden ook een aantal ongekar akteriseerde vermoedelijke immuunproteïnen geïdentificeerd. Het doel van onze studie was om de functie van één van deze ‘nieuwe’ kandidaat- immuunproteïnen te achterhalen. Een interessante vaststelling was de identificatie van het proteïne geco deerd door CG18594 in drie onafhankelijke proteomische studies naar de a angeboren immuniteit in larven en in microarray studies in adulten. Hier in was het proteïne, dat behoort tot de fosfatidylethanolamine-bindende proteïnen (PEBP) familie, steeds sterk opgereguleerd na bacteriële infec tie (Vierstraete et al., 2004a,b; de Morais Guedes et al., 2005; De Gregorio et al., 2002, Apidianakis et al., 2005). Vervolgens hebben we een strategie ontwikkeld om de bi ologische functie van dit proteïne, dat we Drosophila PEBP1 g enoemd hebben te achterhalen gebruikmakend van genetica, overlevingstest en, differentiële proteomics en transcriptomics. Eerst hebben we de aanwezigheid van PEBP1 transcripten aangetoond in het larvale vetlichaam en in de hemocyten, twee belangrijke organen in het immuunsysteem. Vervolgens hebben we transgene vliegen gemaakt die op een tijds- en plaatsspecifieke manier PEBP1 tot overexpressie kunnen brenge n, of zijn synthese kunnen neerreguleren (RNAi) onder controle van het G AL4/UAS systeem. Verder worden ook onze pogingen om een PEBP1 nu ll mutant te maken met behulp van de IMAGO techniek (Choi et al., 2009) beschreven. Overlevingstesten toonden duidelijk aan dat larven die een overexpressie van PEBP1 vertonen sterk beschermd werden tegen een bacteriële infectie . Dit gegeven ondersteunde de hypothese dat PEBP1 allicht een belangrijk immuunproteïne is, en het suggereerde ook dat de hemolymfe van deze lar ven voorbereid was, voorafgaand aan een infectie, om bacteriën te bestri jden. Deze hypothese werd vervolgens onderzocht met een proteomische stu die waarbij het proteïne profiel van de hemolymfe van derde instar larve n met overexpressie van PEBP1 (GAL4/UAS) vergeleken werd met de hemolymf e van controle larven. De identiteit en (vermoedelijke) functies van de opgereguleerde proteïnen suggereerden vervolgens een functie voor PEBP1 in de JAK/STAT reactieweg, in de fenoloxidase cascade, in de humorale re spons en in de proliferatie en differentiatie van hemocyten. Voor de eer ste keer werd dus een PEBP familie lid duidelijk gelinkt aan immuunsigna lisatie, en dus aan het immuunsysteem (Reumer et al., 2009). Tijdens onze proteomische studie werden ook verscheidene proteïnen geïde ntificeerd die niet of matig differentieel gereguleerd waren. Deze beves tigden de bestaande proteoom kaarten van de larvale hemolymfe gedeelteli jk (Vierstraete et al., 2003, Karlsson et al., 200 4). Er werden echter ook twaalf ‘nieuwe’ hemolymfe proteïnen geïdentific eerd die toegevoegd kunnen worden aan deze hemolymfe profiel kaarten. Een tweede strategie om de functie van PEBP1 te ontrafelen maakt gebruik van een ‘real time’ quantitative PCR (qPCR) benadering. Vermits overexp ressie van PEBP1 duidelijk resulteerde in de verhoogde aanwezigheid van (vermoedelijke) immuunproteïnen in de hemolymfe, waren er vermoedelijk i mmuunsignalisatie wegen actief die verantwoordelijk zijn voor deze verho ogde niveau’s van immuunproteïnen. Wij stellen dan ook voor om in de toe komst de qPCR strategie die gebruik maakt van reporters om de activatie van immuuncascades na overexpressie van PEBP1 te signaleren, verder te o ntwikkelen. Als conclusie kunnen we stellen dat ons werk op overtuigende manier een functie voor PEBP1 suggereert in verscheidene immuunreactiewegen en in d e proliferatie en differentiatie van hemocyten in Drosophila larven. &#12288;
Table of Contents: Dankwoord ..................................................................................................I
Table of contents......................................................................................III
List of abbreviations................................................................................. VI
General introduction:.................................................................................. 1
Scientific context and aims of the study ..................................................... 1
Chapter 1.................................................................................................... 5
Introduction to Drosophila genetics ........................................................... 5
1.1. Drosophila melanogaster as a model organism ................................ 5
1.2. The Drosophila genome: some basic notions.................................... 5
1.3. The Drosophila toolbox for forward and reverse genetic approaches:
functional genetics.................................................................................. 7
1.3.1. Introduction................................................................................. 7
1.3.2. P elements: the major transposon system in Drosophila..................... 8
1.3.3. The GAL4/UAS system................................................................... 9
1.3.4. Forward genetics ........................................................................ 11
1.3.5. Reverse genetics ........................................................................ 12
1.3.5.1. Introduction of DNA into the genome....................................... 12
1.3.5.2. Obtaining mutations in specific genes ...................................... 15
1.3.5.3. Altering a gene’s function ...................................................... 16
1.3.5.3.1. Gene targeting: Targeted gene replacement and RNAi ......... 16
1.3.5.3.2. Site-specific recombination .............................................. 20
1.4. Conclusions .................................................................................... 21
Chapter 2.................................................................................................. 23
The PEBP family and Drosophila innate immunity .................................... 23
2.1. Introduction ................................................................................... 23
2.2. The PEBP family ............................................................................. 23
2.2.1. PEBP family members: conserved consensus sequence and structure . 23
2.2.2. PEBP functions ........................................................................... 25
2.3. Drosophila innate immunity ........................................................... 26
2.3.1. Humoral response....................................................................... 27
2.3.2. Cellular response ........................................................................ 32
2.3.3. The phenoloxidase response......................................................... 34
2.3.4. The JAK/STAT cascade in innate immunity ..................................... 35
2.3.5. The antiviral response: implication of RNA interference in the innate
immune system................................................................................... 37
2.3.6. Immune defence systems in epithelial tissues ................................. 39
2.3.7. Similarities between mammalian and insect immune responses......... 40
2.4. Conclusion...................................................................................... 41
Chapter 3.................................................................................................. 43
Exploring Toll and imd signaling with a genetic screen approach ............. 43
3.1. Introduction ................................................................................... 43
3.2. Outline of the genetic screen.......................................................... 43
3.3. Materials and methods ................................................................... 44
3.3.1. Fly lines .................................................................................... 44
3.3.2. Screen design ............................................................................ 45
3.4. Results and discussion ................................................................... 47
3.4.1. Pilot test – survival of GAL4 driven expression of known immune
components ........................................................................................ 47
3.4.2. Pilot test – AMP-GFP induction after induced expression of immune
components ........................................................................................ 48
3.4.3. Pilot test – Monitoring AMP-GFP activation after GAL4 induction of EP
and EY insertions associated with known immune proteins......................... 51
3.5. Conclusions .................................................................................... 53
IV
Chapter 4.................................................................................................. 55
PEBP1 transgenes .................................................................................... 55
4.1. Introduction ................................................................................... 55
4.2. Materials and methods ................................................................... 56
4.2.1. Surveying existing Drosophila transgene and mutant databases ........ 56
4.2.1.1. Database search................................................................... 56
4.2.1.2. Inverse PCR......................................................................... 56
4.2.2. Creation of PEBP1 over/misexpression transgenes .......................... 56
4.2.3. Ends-out recombination based IMAGO approach for creating a PEBP1
null mutant ......................................................................................... 57
4.2.4. RNA interference transgenes ........................................................ 58
4.3. Results and discussion ................................................................... 58
4.3.1. Surveying existing Drosophila transgene and mutant databases ........ 58
4.3.2. P{UAST} bearing insertion lines.................................................... 62
4.3.2.1. Generation of P{UAS-PEBP1} insertion lines ............................. 62
4.3.2.2. Proof of P{UAS-PEBP1} functioning ......................................... 63
4.3.2.3. Inverse PCR to determine the P{UAS-PEBP1} genomic position ... 64
4.3.3. Ends-out recombination based IMAGO approach for creating a PEBP1
null mutant ......................................................................................... 66
4.3.4. RNA interference transgenes ........................................................ 69
4.4. Conclusions and future prospects................................................... 72
Chapter 5.................................................................................................. 75
PEBP1 localization and survival of PEBP1 transgenes after bacterial
infection ................................................................................................... 75
5.1. Introduction ................................................................................... 75
5.2. Material and methods..................................................................... 75
5.2.1. Whole mount one color in situ hybridization.................................... 75
5.2.2. Reverse Transcriptase PCR........................................................... 76
5.2.3. Survival experiment.................................................................... 77
5.3. Results ........................................................................................... 77
5.3.1. Localization of PEBP1 transcripts in embryos................................... 77
5.3.2. Localization of PEBP1 transcripts in third instar larvae...................... 78
5.3.3. Survival of PEBP1 transgenes upon infection................................... 79
5.4. Discussion ...................................................................................... 81
5.4.1. Localization of PEBP1 in embryos .................................................. 81
5.4.2. Localization of PEBP1 in larvae...................................................... 82
5.4.3. Survival of PEBP1 transgenes upon infection................................... 84
5.5. Conclusions and future prospects................................................... 84
Chapter 6.................................................................................................. 87
A proteomic strategy for unraveling PEBP1 functioning ........................... 87
6.1. Introduction ................................................................................... 87
6.2. Materials and methods ................................................................... 87
6.2.1. Transcriptomic approach.............................................................. 87
6.2.1.1. Total RNA extraction from whole Drosophila larvae and cDNA
synthesis......................................................................................... 87
6.2.1.2. Primer design, PCR efficiency, melting curve and validation
experiment ...................................................................................... 88
6.2.1.3. Real Time RT PCR ................................................................. 89
6.2.2. Proteomic approach .................................................................... 89
6.2.2.1. Drosophila lines and genetics ................................................. 89
6.2.2.2. Protein sampling and labeling ................................................. 90
6.2.2.3. DIGE .................................................................................. 90
6.2.2.4. Gel imaging and statistical analysis ......................................... 91
6.2.2.5. Protein identification using mass spectrometry.......................... 91
6.3. Results ........................................................................................... 93
6.3.1. Demonstration of PEBP1 overexpression ........................................ 93
6.3.2. Differentially expressed proteins upon PEBP1 overexpression ............ 94
V
6.3.3. Enlarging the 2D hemolymph proteome database...........................100
6.3.4. Exploring possible functions of PEBP1 with real time PCR.................105
6.4. Discussion .................................................................................... 105
6.4.1. Demonstration of PEBP1 overexpression .......................................105
6.4.2. Inferring possible PEBP1 functions from differentially expressed proteins
upon PEBP1 overexpression..................................................................106
6.4.3. Enlarging the 2D hemolymph proteome database...........................110
6.4.4. Exploring PEBP1 functioning using reporters for examining immune
cascade activation...............................................................................112
6.5. Conclusion and future prospects .................................................. 113
6.5.1. PEBP1 overexpression ................................................................113
6.5.2. Proteomic approach for unravelling PEBP1 functioning.....................113
6.5.3. Transcriptomic approach for unravelling PEBP1 functioning ..............114
General conclusions and future perspectives.......................................... 115
Summary................................................................................................ 121
Samenvatting ......................................................................................... 123
List of publications ................................................................................. 127
Reference List......................................................................................... 129
Addendum Chapter 3 .............................................................................. 139
Addendum Chapter 4: primer sequences ................................................ 141
Addendum Chapter 4: sequencing results of p{lacW} flanking sequences
............................................................................................................... 142
Addendum Chapter 4: nucleotide coding sequence of PEBP1 (CG18594) 145
Addendum Chapter 4: Construction of iPCR primers for genomic position
determination of p{UAS-PEBP1} ............................................................ 145
Addendum Chapter 4: nucleotide sequence of DNA fragment for PEBP1
(CG18594) RNAi donor construction: 348 bp (3R: nt 18291615-
nt18291963) .......................................................................................... 147
Addendum Chapter 5 .............................................................................. 148
ISBN: 978-90-8649-297-8
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Animal Physiology and Neurobiology Section - miscellaneous

Files in This Item:
File Status SizeFormat
definitief-druk.pdf Published 3780KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.