ITEM METADATA RECORD
Title: Structure-function relationships of fructosyltransferases in Triticum Aestivum L. and Lolium Perenne L.
Other Titles: Relatie tussen structuur en functie van fructosyltransferases in Triticum aestivum L. en Lolium perenne L.
Authors: Schroeven, Lindsey
Issue Date: 7-Dec-2009
Abstract: Ongeveer 15% van de bloemplanten hebben de eigenschap ontwikkeld om vacu olair sucrose te verlengen tot fructanen. Deze polymeren van fructose wo rden gesynthetiseerd door verschillende types van fructosyltransferases (FTs), die behoren tot familie 32 van glycoside hydrolasen (GH32). De FT s verschillen in hun donor of acceptor substraat specificiteiten. In tar we (Triticum aestivum L.) leidt een samenspel van 1-SST (sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase), 6-SFT (sucrose:fructan 6-fructosyltransferase) en 1-FFT (fructan:fructan 1-fructosyltransferase) tot de productie van graminan-type fructanen. In Engels raaigras (Lolium perenne L.) is 6G-FF T (fructan:fructan 6G-fructosyltransferase) het sleutelenzym voor de vor ming van neokestose-type fructanen. Het is algemeen aanvaard dat FTs geë volueerd zijn uit vacuolaire invertasen (VIn) (die sucrose hydrolyseren) ; beide soorten enzymen zijn sterk verwant op moleculair en s tructureel niveau, hoewel ze functioneel verschillend zijn. Dit doctoraa tsonderzoek richt zich op drie aspecten met betrekking tot de verschille n in substraat specificiteit tussen de biosynthese-enzymen van de monoco tylen. De resultaten geven inzicht in het onstaan en de evolutie van dez e FTs. De ontrafeling van verschillende 3D-structuren van verwante GH32 (and GH68) enzymen vormden hiertoe een goede uitgangsbasis. In een eerste deel wordt onderzocht hoe FTs de capaciteit hebben ontwikk eld om sucrose in plaats van water te binden als acceptor substraat. Hie rtoe werd het cDNA, coderend voor de volledige lengte van het mature dee l van tarwe VI (TaVI) gekloneerd en gebruikt als templaat om mutaties aa n te brengen. Gebaseerd op 3D-modellen en sequentie alignaties, werden a minozuren W23 and N25 van de geconserveerde WMNDPNG regio geselecteerd v oor mutagenese. De resultaten tonen aan dat een stevig netwerk van H-bru ggen (HBN) bestaat tussen aminozuren W23, N25 and D26, dat typerend is v oor VIn. Verstoring van dit netwerk leidde tot een 17-voudige toename in de transfructosylatie capaciteit in TaVI mutant W23Y+N25S. Bovendien ve rtoonde deze mutant superieure kinetische parameters, met betrekking tot 1-kestose vorming (Km ~ 43 mM), in vergelijking met wild type 1-SST. De ze bevindingen, gecombineerd met mutatie W99L in de WSGSAT regio van TaV I suggereren dat een typische aromatische regio rond de ‘active site’&nb sp; (WMNDPNG, WSGSAT, WGN and WGW) belangrijk is in het creëren van een acceptor bindingsplaats voor water in plaats van sucrose. Een tweede deel werpt een licht op de moleculaire basis voor het verschi l in donor substrate specificiteit tussen enzymen die sucrose verkiezen als donor substraat (S-type enzymen: VI, 1-SST, 6-SFT) en enzymen die fr uctan prefereren als donor (F-type enzymen: 1-FFT, 6G-FFT). De transform atie van L. perenne 6G-FFT in 1-SST (door mutaties N340D, W343R en S415N ) steunt de theorie dat een arginine (of lysine) op positie 343 vereist is om aspartaat op positie 340 in een optimale positie te houden om sucr ose als donor substraat te binden. Bovendien konden mutagenese experimen ten in 1-FFT van tarwe benadrukken dat een functioneel D/R koppel in de hypervariabele lus (HVL) vereist is om S-type kenmerken te creëren. In T a1-SST blijkt Y282 (homoloog van D281 in Ta1-FFT) cruciaal te zijn om ee n stevig HBN te vormen, waarin arginine van het D/R koppel in een stabie le positie wordt gehouden. Dit HBN wordt verstoord in Ta1-FFT en dit lei dt tot een meer flexibel arginine residue en een disfuntioneel D/R koppe l. Door een enkelvoudige D281Y mutatie in Ta1-FFT kon het HBN hers teld worden en werden typische S-type karakteristieken geïntroduceerd. D it kan ook verklaren waarom 1-FFTs van Triticum soorten ook een D/R kopp el vertonen in de HVL, hoewel dit F-type enzymen zijn. Bovendien tonen d eze resultaten aan dat in tarwe FTs, D281 (of een homoloog) betrokken is in de donor substraat specificiteit. Een laatste deel verklaart welke aminozuren bepalend kunnen zijn voor de vorming van het type binding tussen twee fructose-eenheden in fructanen . In het recent gekloneerde 6-SST cDNA van tarwe (Van den Ende, niet-gep liceerde resultaten) beïnvloedden puntmutaties L86W (LSGSIT motief) en E 112Q (VEVQ) de capaciteit om ß(2-6) bindingen te produceren. D eze resultaten wijzen in de richting dat de acceptor sucrose molecule ka n binden op twee verschillende manieren in FTs, die aanleiding geven aan ß(2-1) bindingen of aan ß(2-6) bindingen. De select ieve binding van sucrose in de ß(2-6) configuratie zou een hoo g geëvolueerd kenmerk kunnen zijn, dat waarschijnlijk veroorzaakt is doo r een zeer specifieke combinatie van mutaties. Kort samengevat, het doel van dit doctoraatsonderzoek is onderzoeken op welke manier FTs geëvolueerd kunnen zijn uit een voorouderlijk VI. Hiert oe werden plaatsgerichte mutagenese experimenten uitgevoerd die verhelde ren welke aminozuren betrokken zijn in de verschillende donor en accepto r substraat specificiteiten van FTs of in het type van binding (ß(2 -1) vs ß(2-6)) dat gevormd wordt tussen twee fructose eenheden in fructan. Bovendien konden de mutagenese resultaten gecombineerd word en om een model te ontwikkelen dat de functionaliteit van elk niet-gekar akteriseerd plant GH32 enzym kan voorspellen als snel alternatief voor f unctionele karakterisatie.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory for Molecular Plant Physiology (-)
Molecular Physiology of Plants and Micro-organisms Section - miscellaneous

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Structure function relationships of T. aestivum and L. perenne.pdf Published 38309KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.