ITEM METADATA RECORD
Title: Development of novel tools to study neutrophil proteases and the dual roles of neutrophils in cancer
Other Titles: Ontwikkeling van nieuwe reagentia en methoden om proteasen van neutrofiele granulocyten te bestuderen en de tweeledige rol van deze immuuncellen bij kanker
Authors: Piccard, Helene
Issue Date: 16-Nov-2009
Abstract: In de strijd tegen infecties en kanker is het belangrijk dat ons immuuns ysteem onderscheid maakt tussen lichaamseigen en vreemde substanties (an tigenen) en reageert tegen microbiële of gewijzigde moleculen. De initië le verdedigingsreacties treden snel in werking (reeds na enkele minuten tot dagen) en hebben een breed spectrum. Na circa een week he eft ons lichaam deze reacties vervolledigd met hoogspecifieke responsen via T-celreceptoren en antistoffen. Zo spreekt men van snelle ‘aangebore n’ en trage ‘adaptieve of verworven’ immuniteit. De belangrijkste uitvoe rende cellen van beide takken zijn, respectievelijk, myeloiede cellen en lymfocyten. Ondanks enorme aandacht en intensief wetenschappelijk onder zoek tijdens de voorbije decennia, waarbij men vooral vooruitgang heeft geboekt in verband met de genetische mechanismen van oncogenese, blijft kanker één van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Het huidi g immunologisch kankeronderzoek en de momenteel bestaande immunotherapeu tische middelen voor de bestrijding van kanker zijn over het algemeen ge baseerd op de stimulatie van verworven immuunmechanismen tegen zogenaamd e kankerantigenen. Tumorcellen kunnen echter verworven immuunresponsen o p verschillende manieren omzeilen. Daarom is het wenselijk om een beter inzicht te verwerven in de interacties tussen immuuncellen (van de aange boren immuniteit) en kankercellen, teneinde nieuwe strategieën tegen kan ker te kunnen ontwikkelen. Het onderzoek naar de rol van aangeboren immuniteit in kankerprocessen i s relatief beperkt. Nochtans vormt het aangeboren immuunsysteem de eerst elijnsverdediging van het lichaam tegen infecties en kanker, met cellen die snel en in grote aantallen door signaalmoleculen aangetrokken worden (chemotaxis) naar specifieke plaatsen in het lichaam. Immuuncellen van het aangeboren systeem zijn uitgerust met diverse krachtige moleculen, z oals destructieve of modulerende proteasen (enzymen voor de klieving van eiwitten) en reactieve zuurstofdeeltjes. Tumorcellen kunnen zelf bijdra gen tot chemotaxis van deze immuuncellen door de productie van kleine ch emotactische eiwitten, chemokinen genaamd. Tijdens de voorbije decennia heeft onze onderzoeksgroep expertise verwor ven op gebied van neutrofiele granulocyten, de meest talrijke immuuncell en in het menselijk lichaam. In de wetenschappelijke literatuur schrijft men een duale rol toe aan neutrofiele granulocyten in tumorbiologie: de ze cellen kunnen tumorigenese en andere kanker-gerelateerde processen (b ijv. invasie, metastasering) indijken óf bevorderen. Hiervan werd e en beeld geschetst in Hoofdstuk 1. Vertrekkend van deze gegevens, werd m et dit doctoraatsonderzoek beoogd om nieuwe reagentia en methoden t e ontwikkelen om moleculaire mediatoren van neutrofiele granulocyten (pr oteasen en chemokinen) en de duale rol van neutrofiele granulocyten in t umorbiologie te bestuderen (Hoofdstuk 2). Gelatinase B/matrix metalloprotease-9 (MMP-9) wordt door gestimuleerde n eutrofiele granulocyten “en masse” vrijgezet uit de tertiaire granulen. Het behoort tot de matrix metalloproteasen (MMP’s), een groep van enzyme n die onder meer op efficiënte wijze componenten van de extracellulaire matrix en chemokinen klieven, en zodoende neutrofiele granulocyten helpe n om zich in het lichaam van de gastheer te verplaatsen. Gelatinase B/MM P-9 is structureel een complex molecule dat uit verschillende domeinen b estaat, waaronder een katalytisch, O-geglycosyleerd en hemopexinedomein. Om te onderzoeken of gelatinase B/MMP-9 via zijn O-geglycosyleerd en he mopexinedomein met bepaalde substraten en remmers interageert en op deze wijze eiwitklieving regelt, hebben we vier varianten van gel atinase B/MMP-9 van de mens geproduceerd, namelijk het intacte gelatinas e B/MMP-9 en drie deletiemutanten waarin één of bei de domeinen ontbreken (Hoofdstuk 3). Deze verschillende varianten werden in milligram hoeveelheden tot expressie gebracht in insectencellen en s uccesvol opgezuiverd met behulp van gelatine-affiniteitschromatografie. Dankzij een nieuwe methode om de geproduceerde deletiemutanten enzymatis ch actief te maken met minimale aantasting van het O-geglycosyleerd en h emopexinedomein, kunnen we de vier varianten vergelijken voor hun kataly tische werking op substraten. Met de geproduceerde varianten konden we d e aanwezigheid van suikerstructuren op het O-geglycosyleerd domein en de vorming van multimeren onderzoeken. De productie van deze recombinante deletievarianten van gelatinase B/MMP-9 heeft ondertussen bijgedragen to t nieuwe biologische inzichten betreffende activatie, katalyse, binding van remmers en antilichamen, en receptor-gemedieerde regulatie van biolo gisch actief gelatinase B/MMP-9. Door middel van “proteomics”-technieken kan men het repertoire van subst raten van individuele proteasen onderzoeken, hetgeen “degradomics” wordt genoemd. Aangezien in een biologische omgeving individuele substraten o nderhevig zijn aan de werking van vele proteasen, was er nood aan een te chnologieplatform waarmee de complexiteit van dergelijke biologische pro cessen kon worden onderzocht. Zo wordt een aanzienlijk aantal chemokinen voor neutrofiele granulocyten stapsgewijs vanaf de uiteinden afgeknot ( ‘proteolytische processing’) door al dan niet gekende proteasen. Bij dit onderzoek hebben we granulocyt chemotactisch proteïne-2 (GCP-2) van de muis als substraat gekozen (Hoofdstuk 4). GCP-2 is het krachtigste chemo kine voor de aantrekking van neutrofiele granulocyten in de muis. In bio logische vloeistoffen worden verschillende verkorte varianten van GCP-2 teruggevonden, met een toenemende biologische activiteit naargelang er m eer aminozuren verwijderd zijn van de aminoterminale regio die het ELR-t ripeptide voorafgaat. Bij de aanvang van deze studie was er weinig geken d over betrokken proteasen in deze aminoterminale processing van GCP-2. Onze aanpak, waarbij de ‘trimming’ van een individueel substraat door ee n mix van proteasen wordt bestudeerd, werd “reverse degradomics” genoemd en berust op klieving van een gemerkte substraatprobe door biologische proteasemengsels. Wij hebben deze methode ontwikkeld en verfijnd tot een hogedoorstroomtechnologie die slechts beperkte hoeveelheden startmateri aal en minimale staalvoorbereiding vereist. De technologie werd gevalide erd door het bestuderen van proteolyse in verschillende biologische cont exten, waaronder inflammatie en kanker, en voor de identificatie van pro teaseremmers. In het laatste deel van dit doctoraatsonderzoek (Hoofdstuk 5) hebben we de rol van neutrofiele granulocyten in tumormodellen bij de muis bestude erd, dankzij modulatie van het immuunsysteem met behulp van chloriet-geo xydeerd oxyamylose (COAM), een polyanionisch amylose-derivaat met antivi rale werking. Bij deze studie ontdekten en beschreven we als eersten de antitumorale activiteit van COAM egen onderhuidse melanomen. De an titumorale werking van COAM was uitgesproken, zelfs na slechts eenmalige injectie, dosisafhankelijk en enkel lokaal, hetgeen een aanduiding was voor een niet-adaptief immuuneffect. Bijkomende aanduidingen voor deze s telling kwamen van experimenten waarbij COAM een uitgesproken neutrofili e veroorzaakte na intraperitoneale inspuiting en in onderhuids opgewekte luchtbellen. Bovendien troffen we in behandelde tumoren een verhoging v an neutrofiele granulocyten en macrofagen (myeloiede cellen) aan met beh ulp van immunohistopathologische kleuringen voor oppervlaktemerkers van immuuncellen. De duale rol van neutrofiele granulocyten bij kanker kwam tot uiting wanneer het effect van COAM op peritoneale tumorgroei geanaly seerd werd. Aanzienlijke aantallen myeloide cellen, gerecruteerd onder i nvloed van COAM, waren geassocieerd met een toename in het aantal tumorh aarden. Het is daarom duidelijk dat modulering van de aantallen en funct ies van neutrofiele granulocyten in tumoren specifieke effecten en neven effecten kan veroorzaken en dat verder in vivo onderzoek noodzakelijk is vooraleer men aan algemene klinische toepassingen in kanker kan denken.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Immunobiology (Rega Institute)
Laboratory of Molecular Immunology (Rega Institute)

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Thesis manuscript_091022a.pdf Published 7191KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.