ITEM METADATA RECORD
Title: Pre- and posttranslational mechanisms of regulation of the type 3 iodothyronine deiodinase.
Other Titles: Pre- en posttranslationele regulatiemechanismen van het type 3 joodthyroninedejodase.
Authors: Aerts, Goele
Issue Date: 29-Oct-2009
Abstract: Gepaste schildklierhormoonniveaus zijn essentieel voor verscheidene processen gedurende de ontwikkeling en het volwassen leven van alle vertebraten. Dit impliceert dat de balans tussen de activiteit van de verschillende joodthyronine dejodasen (D1-D3), de enzymen die de schildklierhormonen activeren en inactiveren, cruciaal is voor een norma le ontwikkeling. Daarom vereist de weefselspecifieke en leeftijdsafhankelij ke expressie van de dejodasen een strikte regulatie op de verschillende niv eaus van genexpressie. In deze thesis concentreerden we ons specifiek op de regulatie van de dejodasen op het transcriptionele en posttranslationele niveau. We bestudeerden het mechanisme dat aan de grondslag ligt van de weefselspecifieke repressie van de D3-gentranscriptie geïnduceerd door glucocorticoïden (G Cs), en we identificeerden en onderzochten tevens een nieuw regulatiemechanisme voor D3 op het posttranslationele niveau. Er werd eerder al vastgesteld dat GCs de D3-gentranscriptie in de lever van 18-dagen-oude kippenembryo’s acuut inhiberen, maar het mechanisme voor deze downregulatie was onbekend. Wij veronderstelden dat competitie tussen de glucocorticoïd receptor (GR) en het TATA bindend ei wit voor overlappende bindingsplaatsen in de promoter van het kippen D3-gen aan de grondslag lag van deze repressie. Kloneren van de kippen D3-promoter ont hulde een vermoedelijk glucocorticoïd responsief element (GRE) dat overlapte m et een TATA element, wat erop wees dat competitie voor deze bindingsplaats de D 3-downregulatie zou kunnen induceren. Een vereiste voor ons vooropgesteld mechanisme was de specifieke binding van de GR met zijn GRE, maar we konden de interactie tussen de kippen GR en de vermoedelijke kippen GRE niet ondubbelzinnig bevestig en. Daarenboven konden mutaties in deze vermoedelijke GRE en in de TATA box het negatieve transcriptionele effect van GCs op de D3-promoteractiviteit ni et tenietdoen, zoals werd aangetoond door transfectie-experimenten met de gemuteerde D3-promoter-reportergen-constructen. Deze resultaten suggeree rden dat de vermoedelijke GRE die werd gevonden in de kippen D3-promoter geen echte GRE is en toonden aan dat ons vooropgesteld mechanisme van competitieve DNA-binding niet het eigenlijke mechanisme is van de geobserveerde negatieve effecte n van GCs op de D3-transcriptie in de lever van de kip. Daarop zochten we naar andere regulatorische sequenties in de kippen D3-promoter die een rol zouden ku nnen spelen in de GC-gemedieerde repressie, en hierbij identificeerden we een specifiek gebied dat een GRE half-site bevat evenals een bindingsplaats voor NF-&# 954;B. Beide regulatorische elementen zijn gekend om het moduleren van de GC-respons. Mutatie-analyses gaven aan dat de GRE half-site geen rol speelde in de D 3-inhibitie. NF-κB daarentegen is wel een mogelijke kandidaat om de GC-geïnducee rde repressie van het D3 in de lever te mediëren, maar we hebben zijn rol in dit mechanisme nog niet kunnen bestuderen. Merkwaardig genoeg blijkt de GC-gemedieerde downregulatie van de D3-gentranscriptie in kippenembryo’s weefselspecifiek te zijn, aa ngezien enkel het D3 in de lever onderdrukt wordt, maar niet dat in de hersenen of de nieren. Bij het bestuderen van het mechanisme dat verantwoordelijk is vo or deze weefselspecifieke effecten, onthulde primerextensie-analyse verschillen in de transcriptiestartplaatsen voor het kippen D3-gen in de lever vergeleken met de hersenen. Dit resultaat suggereerde het gebruik van alternatieve promote rs in beide weefsels. Onze pogingen om deze resultaten te bevestigen met behul p van reverse transcriptase PCR en transfectie-experimenten met D3-promoter-reportergenconstructen in een hersencellijn waren voorlopig echter niet succesvol. Vermits er nauwelijks posttranslationele effecten op D1 en D3 gekend waren, wilden we voor deze dejodasen nieuwe regulatiemechanism en ophelderen op het posttranslationele niveau. Daartoe zochten we naar D1- en D3-interagerende eiwitten, gebruikmakende van een aanpak die immunopreci pitatie (IP), 2-dimensionele differentiële gelelectroforese en massaspectrometri e combineerde. Deze methode liet ons toe om één D1-geassocieerd eiwit te identificeren, heat shock proteïne 60, evenals twee D3-interagerende eiw itten, peroxiredoxine 3 (Prx3) en enolase-1. We legden ons vervolgens toe op de interactie tussen Prx3 en D3, vermits we veronderstelden dat Prx3 een ro l zou kunnen spelen in de D3-regeneratie. In de eerste plaats bevestigden we h un interactie in vitro, door de omgekeerde co-IP uit te voeren, en ook in l evende cellen, gebruikmakende van fluorescentie resonantie energietransf er. Het dejoderingsassay in levende cellen onthulde dat knockdown van Prx3 de D3-activiteit met 50% verminde rde in cellen die D3 tot expressie brachten, zonder de D1- of D2-gemedieerde de jodering in levende cellen te veranderen. Daarentegen werd er geen daling in het D3-eiwitniveau waargenomen na Prx3 knockdown, zoals aangetoond door zowe l Western blot analyse als in vitro D3-analyses in celsonicaten. Deze resultaten suggereren een rol voor Prx3 in de regeneratie van het D3-en zym. De vermindering in D3-activiteit in levende cellen kon niet worden toegeschreven aan niet-specifieke oxidatieve stress, vermits een voorbehandeling met het antioxidans N-acetylcysteïne de effecten van Prx 3 knockdown niet kon omkeren. Verder kon thioredoxine, de cofactor voor Prx3-regeneratie, de D3-activiteit in microsomen in stand houden, maar P rx3 knockdown veranderde de D3-activiteit in dit systeem niet, wat erop wijst dat er ook alternatieve mechanismen lijken te bestaan voor het reduceren van D3. Samen wijzen al deze resultaten er sterk op dat Prx3 een specifieke rol speelt in de D3 -regeneratie en dat het de allereerste geïdentificeerde endogene cofacto r voor D3 zou kunnen zijn.
ISBN: 978-90-8649-291-6
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Animal Physiology and Neurobiology Section - miscellaneous

Files in This Item:
File Status SizeFormat
thesis goele.pdf Published 2193KbAdobe PDFView/Open

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.