ITEM METADATA RECORD
Title: Evaluation of antiviral strategies against the severe acute respiratory syndrome coronavirus
Other Titles: Evaluation of antiviral strategies against the severe acute respiratory syndrome coronavirus.
Authors: Keyaerts, Els
Issue Date: 31-May-2006
Abstract: Evaluatie van antivirale strategieën tegen het SARS-coronavirus SARS (severe acute respiratory syndrome) is een aandoening van de luchtw egen die in de winter van 2002 voor het eerst vastgesteld werd in China. Al snel werd ontdekt dat een nieuw coronavirus, het SARS-coronavirus (S ARS-CoV), de oorzaak was van deze atypische longontsteking. Coronaviruss en zijn positief-strengige RNA-virussen die een genoom bezitten van onge veer 30 kb. Ze zijn daarmee de grootste onder alle RNA-virussen. Zoals b ij vele virale infecties was de behandeling van SARS voornamelijk sympto matisch en supportief. Verschillende strategieën kunnen aangewend worden in de zoektocht naar antivirale producten tegen een nieuwe virale aando ening. Een eerste strategie bestaat uit het karakteriseren van de essent iële virale enzymen, gevolgd door het screenen van mogelijke enzyminhibi toren. Een tweede strategie omvat het zoeken naar inhibitoren van struct urele proteïnen, zoals bijvoorbeeld het spike proteïne van het SARS-CoV. Een derde strategie bestaat uit het screenen van producten met behulp v an een cellulaire assay. Hier gaat men niet op zoek naar inhibitoren van één bepaald enzyme of structureel proteïne, maar gaat men nakijken welk e producten mogelijk de groei van het virus inhiberen. In dit doctoraats onderzoek zijn we, gebruik makend van deze laatste strategie, op zoek ge gaan naar antivirale middelen die activiteit vertonen tegen het SARS-cor onavirus (SARS-CoV). In een eerste deel van deze thesis werden hiervoor verscheidene techniek en op punt gesteld die nodig zijn voor de screening en karakterisatie va n anticoronavirale middelen. Er werd een colorimetrische screeningstest ontwikkeld die toeliet een geselecteerde reeks producten uit onze biblio theek te screenen voor hun antivirale activiteit tegen het SARS-CoV. De effectiviteit van een product werd bepaald door de 50% effectieve concen tratie of EC50 te berekenen, dit is de productconcentratie die nodig is om het virus geïnduceerd CPE met 50% te inhiberen. In hoofdstuk 2 ontwik kelden we een kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) assay die een vroege diagno se van een mogelijke SARS-CoV infectie toelaat. Viral-load bepalingen zi jn onontbeerlijk in de klinische virologie aangezien aangetoond werd dat het aantal virale partikels in een klinisch staal een indicatie is voor de ernst en prognose van verschillende infectieziekten, waaronder ook S ARS. Voor deze qRT-PCR rapporteerden wij een snelle, specifieke en gevoe lige detectie en kwantificatie van het SARS-CoV. Er werd een cRNA standa ardreeks aangemaakt om een absolute kwantificatie van het aantal virale kopijen toe te laten. Om een beter inzicht te krijgen in de replicatiecyclus van het SARS-CoV, zijn we in hoofdstuk 3 nagegaan op welk tijdstip na infectie van Vero-c ellen met SARS-CoV voor het eerst nieuw gevormd virus vrijkomt in het ce lsupernatant. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van de qRT-PCR die in h oofdstuk 2 ontwikkeld werd. Intracellulair was er zes uur na infectie ee n stijging van het viraal RNA te zien, extracellulair werd deze RNA stij ging één uur later, dus zeven uur na infectie, zichtbaar. Bij het bepale n van de infectieuze virustiter in het celsupernatant, detecteerden we z even uur na infectie de eerste infectieuze viruspartikels. De kinetiek v an het SARS-CoV werd gedurende twaalf uur gevolgd. Na deze periode werd een intracellulaire virale RNA-load gedetecteerd die 300 keer hoger was dan de begin virale RNA-load. Extracellulair was een 2000-voudige stijgi ng van de virale RNA-load te zien, met een infectieuze virustiter van 5. 2 x 103 CCID50 (de cel cultuur infectieuze dosis, de hoeveelheid virus d ie 50% van de geïnoculeerde cellen infecteert) per ml celsupernatant. Een tweede deel van dit doctoraatsonderzoek omvat het selecteren van ant ivirale producten die de SARS-CoV replicatie in vitro inhiberen. De a ctieve antivirale middelen werden verder getest om het mechanisme te ach terhalen waarmee ze de coronavirusreplicatie inhiberen. In hoofdstuk 4 bespreken we de antivirale eigenschappen van chloroquine, een 4-amino-quinoline, tegen het SARS-CoV. Chloroquinefosfaat had in Ve ro-cellen een 50% effectieve concentratie (EC50) van 9 µM die significan t lager was dan de 50% cytotoxische concentratie (CC50), resulterend in een selectiviteitsindex van 30. De EC50 van chloroquine om SARS-CoV te i nhiberen benadert de plasmaconcentratie van chloroquine die bereikt word en tijdens een behandeling tegen acute malaria. Chloroquine kon in celcu ltuur tot 5 uur na infectie met SARS-CoV toegevoegd worden, zonder een d rastisch verlies van zijn antivirale werkzaamheid. Chloroquine is een kl inisch goedgekeurd antimalaria geneesmiddel. Wanneer SARS terug opduikt kan chloroquine een belangrijke rol spelen als preventief middel voor me nsen die in gebieden leven of naar gebieden reizen waar SARS voorkomt, e n als geneesmiddel voor SARS-patiënten. In een rescue-trail tijdens de SARS-epidemie in Peking kreeg een aantal patiënten een kunstmatige beademing met stikstofmonoxide (NO). Bij deze patiënten werd een verbetering van de longfunctie vastgesteld. Bovendien bleven deze verbeteringen aanhouden na het stopzetting van de behandeli ng. Dit zou kunnen wijzen op een mogelijk antiviraal effect van NO op he t SARS-CoV. Om deze hypothese te testen werd in hoofdstuk 5 onderzocht o f S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), een stof die NO vrijzet, anti- SARS-CoV activiteit vertoont in celcultuur. De EC50 van SNAP is 222 µM e n dit is lager dan de CC50 (588 µM). De afwezigheid van antivirale activ iteit bij NAP, de niet-genitrosyleerde vorm van SNAP, toonde aan dat de werkzaamheid van SNAP tegen het SARS-CoV te danken was aan de vrijzettin g van NO. In deze studie werd extra bewijs geleverd dat NO en NO-donoren een antiviraal effect zouden hebben tegen het SARS-CoV in vitro. In hoofdstuk 6 bestudeerden we de antivirale activiteit van plant lectin es tegen het SARS-CoV en tegen het katten infectieus peritonitis coronav irus (FIPV). Een reeks plant lectines, met verschillende suikerspecifici teit , werd getest voor hun antivirale eigenschappen tegen het SARS-CoV en het FIPV. De mannosespecifieke plant lectines vertoonden de beste ant icoronavirus activiteit. Bij verder onderzoek naar het werkingsmechanism e van deze lectines bleek dat ze op twee punten in de replicatiecyclus k onden inwerken. Een eerste doelwit bevond zich in het begin van de repli catiecyclus. De lectines binden heel waarschijnlijk op de suikergedeelte s van het coronavirus spike glycoproteïne en verhinderen op deze manier de fusie van de virale enveloppe met de cellulaire membraan. Een tweede doelwit situeert zich op het einde van de replicatiecyclus, waar de lect ines mogelijks het vrijkomen van het virus inhiberen. In hoofdstuk 7 behandelen we de in vitro anticoronavirus activiteit v an pyridine N-oxide derivaten. Deze producten werden reeds eerder ger apporteerd als een unieke klasse van HIV antivirale middelen. In tegenst elling tot de anti-HIV activiteit was de oxidevorm van de producten cruc iaal voor het behouden van de anti-coronavirus activiteit. In hoofdstuk 8 toonden we aan dat verschillende glycopeptide derivaten d ie gemodificeerd werden met hydrofobe substituenten selectieve anticoron avirale activiteit vertonen. In het algemeen had het verwijderen van de glycongedeeltes geen effect op de antivirale activiteit van de producten . De time-of-drug-addition experimenten uitgevoerd met FIPV, wijzen erop dat deze aglycon antibiotica derivaten inwerken op een vroege stap in d e coronavirus-infectiecyclus. Dit onderzoekswerk draagt bij tot de kennis over de behandeling van coro navirusinfecties. De karakterisatie en ontwikkeling van anti-SARS-CoV pr oducten kan bovendien nuttig zijn voor de behandeling van andere humane coronavirusinfecties en van economisch belangrijke coronavirusinfecties in gevogelte, vee en huisdieren.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Clinical and Epidemiological Virology (Rega Institute)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.