ITEM METADATA RECORD
Title: RMCE in the LRP1 gene: Functional analysis of knock-in mutants
Other Titles: RMCE in het LRP1 gen: Functionele analyse van knock-in mutanten
Authors: Reekmans, Sara; S0166530;
Issue Date: 10-Feb-2010
Abstract: De receptor LRP1 is betrokken in verschillende functionele pathways gaan de van internalisatie van een breed spectrum van liganden tot een (co-)r eceptor functie in signaling pathways. Hierdoor is de receptor onmisbaar gebleken voor de embryonale ontwikkeling van muizen en is het sterk bet rokken bij diverse ziektes, zoals de ziekte van Alzheimer. De aanwezighe id van meerdere motieven met diverse functies in het intracellulaire dom ein van LRP1, samen met de extreme grootte van het extracellulaire ligan dbindingsdomein van deze celoppervlakte receptor, maakt het echter moeil ijk om de individuele rol van elk van deze motieven te ontrafelen. Daaro m zijn functionele studies vaak gelimiteerd tot in vitro modellen met ov erexpressie van mini-receptoren van LRP1, die een getrunceerd LRP1 eiwit , met inactiverende mutaties in 1 of meerdere van deze motieven, tot exp ressie brengen. Deze artificiële LRP1 overexpressiemodellen benaderen ec hter onvoldoende de fysiologische condities zoals in cellen met endogene expressie van full-lenght LRP1 en zijn bovendien slechts beperkt bruikb aar om de rol van LRP1 in vivo te bestuderen. Daarom werd er in het labo ratorium voor Experimentele Muisgenetica een nieuwe methode ontwikkeld d ie gebaseerd is op de RMCE (recombinase mediated cassette exchange) meth ode. Deze maakt het mogelijk om op een relatief eenvoudige en efficiënte manier, inactiverende knock-in mutaties te genereren in 1 of meerdere m otieven van het endogene LRP1 gen. Met deze methode werden vervolgens mu islijnen gemaakt met inactiverende mutaties in de furine cleavage site, het membraan-proximale intracellulaire NPXY1 motief, het membraan-distal e intracellulaire NPXY2 motief en in beide NPXY motieven tegelijkertijd. Deze muismodellen zijn bovendien de allereerste modellen die het mogeli jk maken om de functie van de diverse motieven in endogeen geëxpresseerd LRP1 in vivo te onderzoeken. Analyses van deze knock-in muizen en hiervan afgeleide MEF cellijnen heb ben aangetoond in muizen met een furine klievingsmutatie dat dit enkel g eassocieerd was met een mild lever fenotype, hoewel de maturatie van LRP 1 zoals verwacht drastisch verminderd was. Inactivatie van het membraan- distale NPXY2 motief had geen drastische gevolgen voor de overleving van de muizen, noch voor de productie en maturatie van LRP1. De endocytose functie van LRP1 in NPXY2 mutante MEFs was echter wel verminderd, zoals verwacht op basis van de gepostuleerde dominante rol van het YXXL motief voor endocytose. Uitschakeling van het membraan-proximale NPXY1 motief veroorzaakte, onverwacht, sterfte van de embryo’s kort voor de geboorte. Daarenboven bleken embryo’s waar beide NPXY motieven uitgeschakeld ware n, slechts te kunnen overleven tot halfweg de zwangerschap. Deze vroegti jdige sterfte van beide mutanten kon verklaard worden door een drastisch e vermindering van gematureerde LRP1 als gevolg van vroegtijdige degrada tie van het full-lenght eiwit in de proteasomen. Deze experimenten hebbe n voor de eerste maal aangetoond dat het membraan-proximale NPXY1 motief een zeer belangrijke rol speelt bij de biosynthese van matuur LRP1. Daarnaast werden NPXY2 mutante muizen ingekruist met een muismodel voor de ziekte van Alzheimer. Deze muizen vertoonden een halvering van het aa ntal amyloïde plaques in hun hersenen ten opzichte van wild-type muizen in dezelfde genetische achtergrond. Een vergelijkbare vermindering van d e hoeveelheid oplosbaar Aß werd eveneens vastgesteld in cerebrospin aal vocht van deze muizen evenals in APP getransfecteerde NPXY2 mutante MEF cellijnen. Deze vermindering bleek niet veroorzaakt door een vermind erde Aß productie noch door een verhoogde Aß degradatie, maar was geassocieerd met verhoogde intracellulaire Aß niveau’s in de he rsenen van de muizen, en suggereert een belangrijke rol voor het membraa n-distale NPXY2 motief voor de efficiënte secretie van Aß. In een laatste objectief werd getracht om de op RMCE-gebaseerde methode te optimaliseren in geïmmortaliseerde MEF cellijnen, met het doel bijkom ende LRP1 mutante MEF cellijnen te kunnen genereren zonder eerst additio nele LRP1 mutante muizen te moeten maken. Deze op RMCE-gebaseerde method e bleek zeer efficiënt voor de targetting van LRP1 allelen in MEFs. Echt er herhaalde pogingen om beide allelen te targetten, bleken telkens te m islukken. Na analyse van metafase chromosomen van geïmmortalizeerde MEF cellijnen bleek een abnormaal hoog aantal chromosomen in deze MEFs, wijz end op een tetraploïde status van de cellen, de oorzaak van het probleem . Dat twee opeenvolgende RMCE rondes leidden tot de succesvolle targetti ng van minstens twee verschillende allelen wijst erop dat de RMCE method e in theorie bruikbaar is om beide allelen in een diploïde cel te target ten. In conclusie, onze analyses hebben aangetoond dat RMCE in the Lrp1 gen z eer geschikt is voor het genereren van LRP1 knock-in muizen. Daarnaast h eeft de functionele karakterisering van deze knock-in muizen en de hierv an afgeleidde MEF cellijnen nieuwe, doch onvolledig gekarakteriseerde fu ncties voor zowel het membraan-proximale NPXY1 als het membraan-distale NPXY2 motief in LRP1 ontrafeld voor respectievelijk de maturatie van het eiwit en de efficiënte secretie van Aß.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Department of Human Genetics - miscellaneous
Molecular Genetics Section (-)

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Thesis_Reekmans_Sara_Final.pdf Published 5109KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.