ITEM METADATA RECORD
Title: High pressure as a tool to investigate amyloid fibrils
Other Titles: Hogedrukstudie van amyloïdfibrillen
Authors: Dirix, Carolien
Issue Date: 12-Jan-2006
Abstract: Hogedrukstudie van amyloïdfibrillen In nagenoeg elk biologisch proces is de tussenkomst van gespecialiseerde eiwitten vereist. Synthese van proteïnen, transport van moleculen doorh een membranen, opslag van energie en katalyse van verschillende reacties : het zijn maar een aantal voorbeelden waarbij de tussenkomst van eiwitt en noodzakelijk is. Voor het uitvoeren van deze verschillende taken is e en diversiteit in structuur vereist. Eiwitten zijn lineaire biopolymeren die opgebouwd zijn uit aminozuren. Deze aminozuren zijn aan elkaar geli nkt door middel van een peptidebinding. Een verschil in lengte en samens telling van deze aminozuren bij verschillende proteïnen geeft aanleiding tot andere structuren. Hieruit blijkt dat een correcte vouwing van het eiwit noodzakelijk is om zijn functie naar behoren te kunnen uitoefenen. Een verkeerde vouwing van het eiwit kan leiden tot een eiwit dat niet l anger functioneel is of tot een aggregaat (Dobson, 2003). Het neerslaan van deze geaggregeerde eiwitten, de zogenaamde amyloïdfibrillen, is één van de kenmerken van een aantal moleculaire ziektes, zoals bijvoorb eeld de ziekte van Alzheimer en spongiforme encefalopathie bij runderen (BSE). Ondanks het feit dat ze uit verschillende eiwitten gevormd kunnen worden, hebben deze amyloïdfibrillen toch een groot aantal gemeenschapp elijke kenmerken, zoals de b-kruisstructuur (Serpell et al., 1997), kleu ring met congorood (Westermark et al., 1999), verhoogde fluorescentie va n thioflavine T (Le Vine, 1997) en een opmerkelijke resistentie ten opzi chte van proteases. De precieze driedimensionale structuur van de amyloï dfibrillen is nog niet opgehelderd. Dit heeft twee redenen: (i) X-strale nkristallografie is niet mogelijk omdat men geen kristallen kan maken va n de amyloïdfibrillen en (ii) omwille van de onoplosbaarheid van de fibr illen is het bepalen van de structuur met kernmagnetische resonantie (NM R) in oplossing ook geen optie. Er werden reeds verschillende modellen v oorgesteld die proberen de driedimensionale structuur van de amyloïdfibr illen te beschrijven. Eén hiervan is de parallelle b-helix (Wetzel, 2002 ). Een aantal eiwitten, zoals de pectinases, nemen van nature deze paral lelle b-helix als conformatie aan (Jenkins & Pickersgill, 2001). Onze aanpak om meer informatie te vergaren over de interacties die belan grijk zijn tijdens de vorming van de fibrillen en over eventuele cavitei ten in de driedimensionele structuur van de amyloïdfibrillen, bestaat ui t het gebruik van hoge hydrostatische druk. Dit kan op verschillende man ieren: (i) De stabiliteit van de amyloïdfibrillen onder hoge druk kan wo rden getest. (ii) De invloed van een hogedrukbehandeling op de fibrillog enese kan worden nagaan. (iii) Het proces van amyloïdfibrilvorming kan o nder druk gevolgd worden. (iv) De stabiliteit onder hoge druk van pectin emethylesterase (PME), een enzym dat als natieve conformatie de parallel le b-helix aanneemt, kan onderzocht en vergeleken worden met de stabilit eit van amyloïdfibrillen. De twee gebruikte technieken in deze studie zi jn Fouriergetransformeerde infraroodspectroscopie (FTIR-spectroscopie) e n atomairekrachtmicroscopie (AFM). FTIR-spectroscopie biedt enerzijds de mogelijkheid om de secundaire structuur van eiwitten te achterhalen en met behulp van de diamantaambeeldcel (DAC) kunnen drukgeïnduceerde veran deringen in situ gevolgd worden tot 1,5 GPa. AFM geeft anderzijds i nformatie over de morfologie van de aggregaten in functie van de tijd of na drukbehandeling. Ook andere eiwitten die niet met een ziektebeeld geassocieerd zijn, zoal s bijvoorbeeld insuline, kunnen amyloïdfibrillen vormen. Dit suggereert dat de eigenschap om deze fibrillen te vormen algemeen is. In hoofdstuk 5 werd de fibrilvorming van het wildtype (WT)-insuline onderzocht en ver geleken met dat van twee mutanten, nl. despentapeptide-insuline (DPI) en des-(B1,B2)-insuline. Bij DPI zijn er vijf aminozuren aan het carboxylu iteinde van de B-keten verwijderd, bij des-(B1,B2)-insuline werden twee aminozuren aan de N-terminus van diezelfde keten weggehaald. De fibrilvo rming bij WT-insuline, DPI en des-(B1,B2) was gelijkaardig, op enkele kl eine verschillen na. De band die karakteristiek is voor de b-vouwbladstr uctuur heeft een kleine roodverschuiving ondergaan in het IR-spectrum va n de mutanten. Ook op het vlak van morfologie kan men opmerken dat er bi j de fibrillen van WT-insuline een helicale draaiing terug te vinden is, maar niet bij de fibrillen van de insulinemutanten. Eerder al werd gepo ogd een correlatie te vinden tussen de positie van de band die duidt op b-vouwbladstructuur en de verschillende morfologie, maar deze bleek niet te kloppen (Nielsen-Garriques et al., 2002). Drukbehandeling van de WT- insulinefibrillen tot 1 GPa leverde enkel maar kleine veranderingen op i n het spectrum. We konden echter geen ontvouwing van de fibrillen waarne men. De drukstabiliteit van de fibrillen gevormd door de insulinemutante n was gelijkaardig. Om meer inzicht te krijgen in de veranderingen die o nder druk gebeuren, werd de waterstof/deuterium (H/D)-uitwisseling gevol gd onder druk. Dit experiment maakte duidelijk dat er zelfs onder hoge d ruk geen volledige uitwisseling van protonen tegen deuteronen plaatsvond . Hieruit kunnen we besluiten dat de insulinefibrillen op zijn minst een kern moeten hebben die niet toegankelijk is voor het solvent, zelfs nie t onder hoge druk. Een mogelijke verklaring voor de kleine veranderingen die werden waargenomen in het IR-spectrum, is dat de protofilamenten wa aruit fibrillen bestaan, uit elkaar gaan, waarbij een kern van b-vouwbla dstructuur behouden blijft. Al deze veranderingen onder druk waren omkee rbaar, zoals bleek uit het IR-spectrum bij atmosferische druk en de AFM- beelden na drukbehandeling. Deze resultaten zetten er ons toe aan om een ander amyloïdsysteem onder druk te bestuderen. Transthyretine105-115-peptide (TTR105-115), de b-str eng G in transthyretine, werd bestudeerd in hoofdstuk 6. Van dit peptide was reeds aangetoond dat men er in vitro vlot fibrillen van kan ma ken (Gustavsson et al., 1991). De fibrilvorming bij TTR105-115 gaat trag er dan bij insuline, wat de mogelijkheid biedt om de drukstabiliteit op verschillende momenten in het proces te onderzoeken. Na één dag is er in het spectrum van TTR105-115 een smalle band bij 1624 cm-1 (b-vouwb ladstructuur) op te merken, maar ook nog enkele andere banden, die bijdr agen zijn van bochtstructuren en ongeordende structuren. Op de AFM-beeld en kunnen we zien dat er in dit stadium zowel fibrillair als amorf mater iaal aanwezig is. De hogedrukstudie toonde aan dat deze vroege aggregate n reeds bij een druk van ~200 MPa gedissocieerd kunnen worden. Na een in cubatie van vier dagen ligt het maximum van de amide I’-band uitgesproke n bij 1624 cm-1. Op dat tijdstip zijn op de AFM-beelden mature amyloïdfi brillen waar te nemen. Het IR-spectrum en de morfologie van TTR105-115 l ijken op die van insuline. Hogedrukbehandeling tot 1,2 GPa was niet vold oende om enige verandering in het IR-spectrum van de mature TTR105-115-f ibrillen te induceren. Zelfs een combinatie van hoge druk en hoge temper atuur slaagde er niet in om het b-vouwbladgehalte te verminderen. Deze r esultaten zijn in strijd met de drukdestabilisatie die gevonden werd voo r TTR zelf en a-synucleïne (Foguel et al., 2003). De amyloïdfibrillen va n deze eiwitten konden beide gedissocieerd worden bij een druk van ~200- 300 MPa. Blijkbaar hebben de fibrillen gevormd door verschillende proteï nen of peptiden niet dezelfde drukstabiliteit. Een verklaring hiervoor z ouden we kunnen vinden door te veronderstellen dat de fibrillen onderzoc ht door Foguel et al. (2003) slechts vroege aggregaten waren en nog geen mature fibrillen. De drukinstabiliteit die gevonden werd voor de vroege aggregaten van TTR105­115 wijst erop dat in het vroege stadium van de fibrilvorming vooral hydrofobe en elektrostatische interacties, die t egengewerkt worden door druk, een belangrijke rol spelen. In een later s tadium kunnen we de drukstabiliteit van de mature fibrillen verklaren do or het hechte waterstofbruggennetwerk dat gevormd wordt en de afwezighei d van caviteiten. Er werd na de drukbehandeling van de vroege aggregaten van TTR105-115 re eds opgemerkt dat de intensiteit van de band bij 1624 cm-1, die wijst op b-vouwbladstructuur, was gestegen. Dit suggereert dat door de drukbehan deling meer fibrillen gevormd werden. In hoofdstuk 7 bestuderen we de ei genschappen van deze drukgeïnduceerde fibrillen. AFM-beelden genomen voo r en na de drukbehandeling toonden inderdaad een verhoogde opbrengst aan fibrillen aan. Deze drukgeïnduceerde fibrillen hadden dezelfde morfolog ie en IR-spectrum als de fibrillen die gevormd werden bij atmosferische druk. Als we echter naar hun drukstabiliteit kijken, dan zien we dat dez e drukgeïnduceerde fibrillen deze stabiliteit nog niet verworven hadden, maar het toepassen van meerdere cycli verhoogde wel hun drukstabiliteit . Deze hogere opbrengst aan fibrillen lijkt erop te wijzen dat drukbehan deling een kleine verandering induceert in de conformatie. Deze gewijzig de conformatie heeft een grotere neiging tot fibrilvorming. Andere verkl aringen zijn dat drukbehandeling meer nuclei induceert of dat intermedia iren, die niet naar fibrilvorming leiden, gedissocieerd worden door hoge druk. Meer informatie over de drijvende kracht achter de fibrilvorming van TTR105-115 en insuline kan verkregen worden door deze te volgen bij relatief lage druk (~100-120 MPa). Hierbij vonden we dat de fibrillogene se bij TTR105­115 vertraagd werd; de fibrilvorming bij insuline daar entegen werd volledig geïnhibeerd. Voor insuline kan de verklaring voor de volledige inhibitie gezocht worden in het feit dat de combinatie hoge temperatuur (nodig voor fibrilvorming) en druk zorgde voor een volledig ontvouwen conformatie van insuline. Deze conformatie is vermoedelijk te sterk ontvouwen om nog aanleiding te geven tot fibrillen. Anderzijds ka n het zijn dat hydrofobe en elektrostatische interacties zo belangrijk z ijn bij de eerste stappen van fibrilvorming van insuline, dat het tegenw erken hiervan door de drukverhoging het proces volledig inhibeert. Voor TTR105-115 blijken daarentegen zowel waterstofbrugvorming als hydrofobe interacties een rol te spelen in het vroege stadium van fibrilvorming, g ezien het proces enkel vertraagd maar niet geïnhibeerd werd. De belangri jke rol van de waterstoffen in dit stadium werd bevestigd door een molec ulairedynamicastudie op dit peptide (Paci et al., 2004). In hoofdstuk 8 werd tenslotte de drukstabiliteit van de mature fibrillen vergeleken met die van PME van Aspergillus aculeatus. Voor dit enzym we rd reeds eerder aangetoond dat er geen drukinactivatie bekomen kon worde n na behandeling bij 700 MPa (Duvetter et al., 2005). Gezien de natieve conformatie van PME de parallelle b-helix, één van de voorgestelde modellen voor de opbouw van de amyloïdfibrillen, is, zouden deze structu ren wel eens gelijkaardig kunnen zijn. Hogedrukbehandeling tot 1 GPa lei dde niet tot ontvouwing van de conformatie van PME. Boven 1 GPa namen we wel veranderingen waar in het IR-spectrum die duiden op ontvouwing. Hie ruit kunnen we besluiten dat de druk die nodig is om PME te ontvouwen (1 GPa), hoger ligt dan voor de meeste eiwitten en dus van dezelfde groott eorde is als de drukstabiliteit van de mature TTR105-115-fibrillen. De h oge drukstabiliteit van de b-helices kan verklaard worden door het hecht e waterstofbruggennetwerk, de afwezigheid van caviteiten en de verticale stapeling van alifatische en aromatische aminozuurresiduen in de b-heli x. Terwijl mature fibrillen ook stabiel zijn bij hoge temperaturen, word t deze eigenschap niet teruggevonden bij PME. De ontvouwings- en ook ina ctivatietemperatuur voor dit enzym ligt bij ~55°C (Duvetter et al., 2005 ). Dit wijst erop dat er toch nog een verschil moet zijn tussen natieve parallelle b-helices en amyloïdfibrillen, wat er voor zorgt dat deze laa tsten zowel stabiel zijn bij hoge druk als bij hoge temperatuur. Een hog ere dehydratatiegraad van de amyloïdfibril is een mogelijke verklaring h iervoor. We kunnen hieruit besluiten dat het gebruik van hoge druk veel mogelijkh eden biedt om informatie te verkrijgen over de structuur van amyloïdfibr illen en de verschillende interacties die een rol spelen tijdens de fibr ilvorming. Het is zelfs mogelijk om de fibrilvorming van TTR105-115 ener zijds te vertragen onder druk, anderzijds werd een verhoogde opbrengst a an fibrillen verkregen na hogedrukbehandeling. Een snellere en hogere pr oductie van amyloïdfibrillen biedt de mogelijkheid om geneesmiddelen voo r amyloïdziekten efficiënter te testen.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Chemistry - miscellaneous
Biochemistry, Molecular and Structural Biology Section
Molecular Imaging and Photonics

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.