ITEM METADATA RECORD
Title: LEDGF/p75 as a new target for HIV-1 antiretroviral therapy
Other Titles: LEDGF/p75 as a new target for HIV-1 antiretroviral therapy
Authors: Vandekerckhove, Linos; S0061623
Issue Date: 22-Sep-2006
Abstract: In 1983 werd een retrovirus geïsoleerd uit een patiënt met klinische sym ptomen van AIDS en uiteindelijk werd dit virus het Human Immunodeficienc y Virus of HIV genoemd. Nu, 25 jaar later, zijn er meer dan 65 miljoen mensen geïnfecteerd met HIV en meer dan 25 miljoen mensen zij n reeds gestorven aan AIDS. Op wereldschaal kan men stellen dat nieuwe i nfecties voornamelijk voorkomen in de leeftijdsklasse van 15 tot 24 jaar . Vierenzestig procent van de geschatte 40 miljoen HIV geïnfecteerden, l eeft in sub-Saharisch Afrika. De twee eerste decennia was de aandacht st erk gericht op de epidemiologie en het beschrijven van een duidelijk kli nisch beeld van HIV infectie. Antivirale middelen werden met succes ontw ikkeld en opgestart. Clinici beschikken over meer dan twintig verschille nde, door de overheid goedgkeurde, medicaties voor HIV-1 infectie die on derverdeeld worden in vier klassen. Het is echter zo dat het HIV virus r esistent kan worden aan deze antiretrovirale therapie bij patiënten die langdurig antiretrovirale middelen innemen. Dit probleem stelt zich voor lopig enkel in onze westerse wereld. Gezien er meer en meer initiatieven zijn om tevens antiretrovirale therapie ter beschikking te stellen in d e Derde Wereld kunnen we eenzelfde probleem, met selectie van resistente virussen, in de toekomst verwachten. De genomische capaciteit van HIV-1 is beperkt. Om de replicatiecyclus vl ot te laten verlopen interageren virale eiwitten met cellulaire ei witten en wordt de cellulaire machinerie gebruikt. In ons laboratorium w ordt vooral onderzoek verricht op het integratieproces van HIV-1 en spit sen we ons toe op de interactie van het viraal eiwit integrase met het c ellulair eiwit LEDGF/p75. LEDGF/p75 werd oorspronkelijk beschreven in on s laboratorium als een bindingspartner van integrase. Via co-immunopreci pitatie vanuit nucleare extracten van 293T cellen die het integrase stab iel tot overexpressie brachten, werd LEDGF/p75 geïdentificeerd als integ rase interactor. In het begin van mijn doctoraatsperiode was de interact ie tussen de twee proteïnen in vitro en in vivo reeds aanget oond, maar de rol van dit proteïne tijdens virale replicatie was nog nie t bekend. Ons laboratorium heeft ervaring in het gebruik van de lentivir ale vector technologie. Daarom pasten we deze techniek ook toe om constr ucten die interfereren met de normale LEDGF/p75 functie, tot expressie t e brengen in de cel, om op die manier deze potentiële co-factor te valid eren. In 2002, toen dit project werd opgestart, werd RNA interferentie v oor het eerst beschreven als een nieuwe techniek om doelwitten te valide ren. RNA interferentie is een proces waarbij dubbel strengig RNA van 19- 21 baseparen lang een sequentie specifieke mRNA degradatie induceert. Eé n streng is complementair aan het mRNA van het doelwitproteïne. Binding aan dit sequentie specifieke mRNA resulteert dan in een inhibitie van de expressie van het doelwitgen, met knock-down van het doelwiteiwit tot g evolg. Om stabiel knock-down van LEDGF/p75 te bekomen werden meerder haa rspelden tegen LEDGF/p75 mRNA ontworpen, en stabiel tot expressie gebrac ht via een lentiviraal expressiesysteem. Daarnaast induceerden we tijdel ijke knock-down van LEDGF/p75 via transfectie met dubbelstrengig RNA. Ge zien dit ook in ons laboratorium een nieuwe techniek was, werd de techni ek eerst geoptimaliseerd. Daarom werd de sterkte van de knock-down geëva lueerd, alsook werden mogelijke neveneffecten zoals toxiciteit en aspeci fieke inhibitie van genexpressie nagekeken. Een volledige karakterisatie werd uitgevoerd in cellijnen waarin LEDGF/p75 zowel tijdelijk als conti nu werd onderdrukt en verschillende controlecellijnen werden parallel me egenomen in deze experimenten. De virale replicatie werd vijfvoudig o nderdrukt en dit in zowel tijdelijke als stabiele LEDGF/p75 knock-down c ellijnen. In de cellijnen waarin LEDGF/p75 stabiel werd onderdrukt, werd het eiwit via een expressieplasmide terug tot expressie gebracht, en in deze cellijnen konden we de virale replicatie herstellen tot eenzelfde niveau als in wild type cellen. In een volgende stap gebruikten we moleculaire technologiëen om de knock -down van een doelwitproteïne via lentivirale vectortechnologie nog te v erbeteren. Het is namelijk zo dat niet alle 21-bp sequenties kunnen gebr uikt worden om een efficiënte knock-down van een doelwiteiwit te bekomen . Andere parameters die de knock-down kunnen beïnvloeden zijn echter nog onvoldoende bestudeerd. Hier tonen we aan dat de lus die de sense en an tisense streng van een haarspeld met elkaar verbindt een belangrijke fac tor is om tot een efficiënte knock-down te komen. We tonen aan dat een l us die gebaseerd is op een miRNA23 sequentie resulteert in een betere ex port van de haarspeld vanuit de nucleus naar het cytoplasma, met een eff iciëntere knock-down tot gevolg. De laatste jaren was het controversieel of LEDGF/p75 nu al dan niet bela ngrijk was voor virale replicatie. Verschillende groepen voerden LEDGF/7 5 knock-down experimenten uit en bekwamen tegenovergestelde resultaten. Recent werden echter door deze groepen niet-gepubliceerde data voorgeste ld, met betere RNAi knock-down of via uitschakeling van het LEDGF/p75 ge n, waarbij geconcludeerd wordt dat LEDGF/p75 inderdaad belangrijk is voo r virale replicatie. Deze resultaten bevestigen dus onze eerder gepublic eerde data. Naast de knock-down benadering werden door ons cellijnen aangemaakt waar in het C-terminaal uiteinde van LEDGF/p75 tot overexpressie wordt gebrac ht. Dit C-terminaal fragment bevat het integrase bindings domein (IBD) v an LEDGF/p75. Deze getrunceerde LEDGF fragmenten inhiberen de HIV-1 repl icatie sterk. Dit antiviraal effect wordt niet waargenomen wanneer een g etrunceerd fragment waarin één mutatie aangebracht werd die de interacti e met integrase opheft, tot overexpressie wordt gebracht. We evalueerden de overexpressie van C-terminale fragmenten met verschillende expressie systemen (CMV versus tetracycline reguleerbare promotor), in verschillen de cellijnen (293T, HeLaP4, MT4) en met verschillende virus stammen (NL4 .3, IIIB, P10 – diketozuur resistente stam). We valideerden LEDGF/p75 al s een nieuw doelwit voor de inhibitie van HIV-1 replicatie door aan te t onen dat er een meer dan honderdvoudige inhibitie is van de HIV replicat ie in relevante T cellijnen waarin de integrase-LEDGF interactie wordt g eïnhibeerd. Het is onwaarschijnlijk dat er een immuunreactie zal optrede n wanneer er een fragment van LEDGF/p75 tot overexpressie zou gebracht w orden, gezien LEDGF/p75 zelf een cellulair eiwit is. Daarom zal het nutt ig zijn om het IBD tot overexpressie te brengen in T cellen of in hemato poietische stamcellen om deze gentherapeutische benadering voor de behan deling van HIV-1 infectie te evalueren. Anderzijds is het zo dat de kris talstructuur van het IBD in één complex met het integrase catalytisch do mein recent werd opgehelderd. Dit opent onmiddellijk nieuwe mogelijkhede n om, rekening houdend met deze kristalstructuur, drugs te gaan screenen die specifiek de LEDGF-IN interactie inhiberen. Dit werk valideert de L EDGF-IN interactie als een nieuw doelwit voor antivirale therapie en dit betekent dan ook de start van de ontwikkeling van HIV remmers gericht t egen dit nieuw doelwit.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Molecular Virology and Gene Therapy
Faculty of Medicine, Campus Kulak Kortrijk

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.