ITEM METADATA RECORD
Title: Biochemical and functional analysis of the twin-arginine translocation complex in Streptomyces lividans
Other Titles: Biochemische en functionele analyse van 'twin-arginine'- translocatiecomplex in Streptomyces lividans.
Authors: De Keersmaeker, Sophie
Issue Date: 27-Nov-2006
Abstract: In het kader van de heterologe productie van eiwitten voor biofarmaceuti sche, diagnostische of andere industriële toepassingen, werd eerder reed s Streptomyces lividans voorgesteld als potentieel interessante waa rdcel. Algemeen is de strategie om heterologe eiwitsecretie bij bacterië le waardcellen te bewerkstelligen, de coderende sequentie van het gewens te proteïne te fusioneren aan een Sec/SRP-afhankelijk signaalpeptide, he tgeen echter niet altijd resulteerde in een efficiënte secretie van het bedoelde eiwit. Recent werd in S. lividans de “twin-arginine translocati e”-secretieweg ontdekt, die in tegenstelling tot de Sec/SRP-secretieweg, eiwitten in een gevouwen conformatie kan transporteren. Deze Tat-weg ka n bijgevolg een interessant alternatief vormen voor de secretie van eiwi tten die incompatibel zijn met de Sec/SRP-weg. Gedetailleerde kennis omt rent de werking van de Tat-secretieweg in S. lividans is echter nog bepe rkt. Het doel van dit werk was bijgevolg een beter inzicht te verkrijgen in het Tat-systeem van S. lividans, meer bepaald in de samenstelling en grootte van de gevormde complexen en in hun substraatspecificiteit. Er werd aangetoond dat het Tat-systeem van S. lividans uit 3 verschillen de Tat-proteïnen bestaat, met name TatA, TatB en TatC, dit in tegenstell ing met de meeste Gram-positieve bacteriën die enkel een TatA- en TatC-c omponent bezitten. Mutationele analyse toonde aan dat TatA en TatB, in tegenstelling tot TatC, elk afzonderlijk niet-essentieel zijn voor T at-afhankelijke secretie in S. lividans. Deze resultaten suggereerd en dat TatA en TatB een overlappende functie bezitten, maar niettemin id entificeerden we ook belangrijke verschillen. Zo bleek enkel TatB belang rijk te zijn voor de stabilisatie van TatC. Een belangrijke waarneming w as dat TatA en TatB ook als oplosbaar proteïne voorkomen in het cytoplas ma, en dus niet uitsluitend geassociëerd zijn met de cytoplasmatische me mbraan zoals bv., in Escherichia coli. Onze resultaten toonde n verder de affiniteit aan van oplosbaar TatA en TatB zowel voor Tat-afh ankelijke preproteïnen als voor membraangebonden TatC, die fungeert als receptor ter hoogte van de cytoplasmatische membraan. Dit doet veronders tellen dat oplosbaar TatA en TatB betrokken zijn bij de begeleiding van Tat-afhankelijke preproteïnen naar het translocase. Isolatie en daaropvolgende karakterisatie van Tat-complexen afkomstig va n de membraan en van cytoplasmatische fracties van S. lividans wildtype en enkelvoudige tat mutanten toonden aan dat in de membraan van S. livid ans Tat-complexen met een gelijkaardige grootte en samenstelling aanwezi g zijn als in de membraan van Escherichia coli. Dit wijst erop dat het T at-systeem op structureel vlak sterk geconserveerd is in Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën. Bovendien suggereert de aanwezigheid van 3 verschillende complexen in de membraan dat het Tat-systeem in S. lividan s een dynamisch systeem is dat gebruik maakt van meerdere complexen die met elkaar associëren tot een functioneel Tat-complex. Tot slot kon uit deze studies besloten worden dat oplosbaar TatA en TatB in het cytoplasm a aanwezig zijn als TatAB-complexen en dat TatC de belangrijkste drijfve er is voor assemblage van het functioneel Tat-complex in de membraan. Op basis van deze data werd een werkingsmechanisme van het Tat-systeem in S. lividans voorgesteld. Tenslotte toonden we aan dat TatABC-overproductie de Tat-afhankelijke se cretiecapaciteit van S. lividans sterk verhoogde. Een S. lividans stam w aarin TatABC gelijktijdig met PspA, een eiwit betrokken in het onderhoud en van de “proton motif force”, tot overproductie wordt gebracht zou van uit biotechnologisch standpunt een interessante gastcel kunnen zijn. Tev ens stelden we vast dat TatABC-overproductie in S. lividans de Sec-afhan kelijke secretie negatief beïnvloedt, hetgeen duidt op een “cross-talk” tussen de Sec- en Tat-secretieweg in S. lividans. De vastgestelde “cross -talk” is hoogst waarschijnlijk het gevolg van suboptimale herkenning va n Sec- en Tat-substraten door oplosbaar TatAB en SecA, respectievelijk. Een verdere modulatie van Tat/Sec-substraten om herkenning door SecA/Tat AB te vermijden zou de opbrengst van recombinante eiwitproductie via de Tat/Sec-secretieweg in S. lividans kunnen verbeteren.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Molecular Bacteriology (Rega Institute)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.