ITEM METADATA RECORD
Title: Biochemische karakterisatie en validatie van de gist Saccharomyces cerevisiae als modelsysteem voor de tau-pathologie in de ziekte van Alzheimer
Other Titles: Biochemical characterisation and validation of the yeast Saccharomyces cerevisiae as modelsystem for the tau- pathology in Alzheimer's disease.
Authors: Vandebroek, Tom; S0013389
Issue Date: 7-Jul-2006
Abstract: Proteïne tau is een microtubule-geassocieerd proteïne (MAP) dat verantwo ordelijk is voor de stabilisatie en de ordening van microtubuli (MT) in het centraal zenuwstelsel. De binding van proteïne tau is onderhevig aan complexe regulatie door fosforylering. Het fysiologisch belang van prot eine tau is in negatieve zin geïllustreerd door een pleiade van neurodeg eneratieve ziekten, gezamenlijk tauopathieën genoemd, met onder andere F rontotemporale Dementie en de ziekte van Alzheimer. Tauopathieën worden gekarakteriseerd door intraneuronale accumulatie van “paired helical fil aments” (PHF) bestaande uit proteïne tau dat steeds overmatig gefosforyl eerd is, hetgeen wijst op een belangrijke bijdrage van fosforylering in het pathologische proces van alle tauopathieën. De kinasen GSK-3b and cd k5 zijn belangrijke kinasen van proteine tau in vivo , maar hun ex acte rol en bijdrage, vooral van cdk5, blijft echter dubbelzinnig en zel fs controversieel. De bijdrage van pathologische conformaties aan de agg regatie van proteïne tau werd gesuggereerd, maar een definitief molecula ir verband tussen fosforylering, conformatie-verandering en aggreg atie van proteïne tau moet nog experimenteel bewezen worden in relevante fysiologische omstandigheden. De ziekte van Alzheimer, de meest voorkomende tauopathie, wordt vermoede lijk veroorzaakt door de vorming en accumulatie van kleine aggregaten va n de amyloïde peptiden. Klinische mutaties in het gen dat codeert voor p roteïne tau, veroorzaken niet de ziekte van Alzheimer maar Frontotempora le Dementie (FTD), een gevarieerde groep van autosomaal, dominant overer fbare tauopathieën. De afwezigheid van amyloïde plakken in FTD bewijst d at disfunctie van proteïne tau op zichzelf neurodegeneratie kan veroorza ken zonder amyloïed pathologie. Bovendien wordt de tauopathie in de ziek te van Alzheimer voorgesteld als de “executeur” van neuronen onder druk van de amyloïed pathologie. Deze werk-hypothese draagt onze studies naar de mechanismen van het ontstaan van amyloïed en tau-pathologie in cellu laire systemen en in transgene muizen, als experimentele modellen. Om fundamentele vragen te beantwoorden betreffende de bijdrage van prote ïne kinasen, fosfatasen, chaperones,... in tauopathieën, blijft analyse van de hersenen van patiënten belangrijk. Ante mortem en post mortem effecten kunnen echter vele parameters beïnvloeden zoals proteolyse en defosforylering, waardoor resultaten dubbelzinnig en moeil ijk te interpreteren worden. Transgene muizen blijven het meest belangri jke diermodel om zowel vroege als late aspecten en de progressie van de neurodegeneratieve ziekte te onderzoeken. Buiten de lange generatietijd en de hoge kosten is de complexiteit van de hersenen met zijn heterogene celpopulatie een belangrijk nadeel waardoor definiëring van moleculaire mechanismen belemmerd wordt. Gistcellen zijn het minst complexe eukaryotisch organisme dat desondanks de relevante signaaltransductiepaden en kinasen, o.a. functionele homol ogen van GSK-3b en cdk5, bevat. De sterke structurele en functionele gel ijkenis met de tegenhangers in zoogdieren spoorde ons aan om humaan prot eïne tau tot expressie te brengen in gist om de fosforylering ervan te b estuderen. De gehumaniseerde giststammen geven niet enkel belangrijke fu ndamentele inzichten maar worden bovendien aangewend en toegepast om de effecten van gekende en experimentele farmaca voor eventuele behandeling voor tauopathieën nader te bepalen. We hebben aangetoond dat humane tau isovormen die tot expressie gebracht werden in gist, pathologische fosfo-epitopen verwierven, een pathologis che conformatie aannamen en aggregaten vormden. Deze eigenschappen werde n gemoduleerd door gistkinasen Mds1 en Pho85, de orthologen van zoogdier kinasen GSK-3b en cdk5, respectievelijk. Inactiveren van Mds1 leidde to t een vermindering van tau-fosforylering op Ser396/Ser404 (AD2) and Ser4 09 (PG5). Deficiëntie van Pho85 verhoogde verrassend genoeg de fosforyle ring van tau-4R, samen met de vorming van pathologische conformatieveran dering en een 40-voudige verhoging van tau aggregatie. Oplosbaar proteïn e tau dat gezuiverd werd uit gist zonder Pho85, vormde spontaan en snel tau filamenten in vitro. Verdere fractionering van tau met behulp van een anionen-uitwisselaar leverde een hyper-gefosforyleerde monomere subfractie, genaamd hP-tau/MC1, met een lage elektroforetische mobilitei t en aangerijkt in alle belangrijke pathologische epitopen, inclusief de conformationele epitoop van MC1. Geïsoleerd hP-tau/MC1 versnelde in vitro aggregatie van wild-type tau-4R, hetgeen de functionele capacit eit om tau aggregatie te veroorzaken bewijst, alsook zijn structurele st abiliteit. Introductie van een FTDP-17 mutatie in tau resulteerde in een verminderd e fosforylering van C-terminale aminozuren in tau-R406W en in mindere ma te in tau-P301L. Ondanks deze vermindering hadden de meeste mutanten een verhoogde neiging tot het vormen van pathologische conformaties met ver volgens verhoogde aggregatie van tau in de gist-cellen. Mds1-deficiëntie veroorzaakte een vermindering van tau-aggregatie voor tau-G272V, -N279K , -DK280 and -P301L wat aantoont dat ook de aggregatie van deze mutanten in gist afhankelijk blijft van de fosforylering aan de C-terminus. Tau- R406W is de belangrijke uitzondering omdat de aggregatie van deze mutant onafhankelijk bleek te zijn van Mds1 activiteit wat suggereert dat de R 406W-mutatie structurele veranderingen veroorzaakt die fosforylering aan de C-terminus imiteren. Tenslotte hebben we ons onderzoek uitgebreid naar de biochemische en fys iologische eigenschappen van proteïne tau, te weten de binding aan MT in relatie tot zijn pathologische rol bij tauopathieën, waarbij de rol van fosforylering en aggregatie van tau betrokken werd. Recombinante tau is ovormen werden geïsoleerd uit wild-type, mds1D and pho85< /&gt;D gist om hun binding aan taxol-gestabiliseerde MT te bestuderen in relatie tot zijn fysiologische fosforylatie-patroon. Binding van wil d-type tau-4R was afhankelijk van de fosforylatie-graad omdat defosforyl ering de binding drastisch verhoogde. Binding van tau, gefosforyleerd do or en geïsoleerd uit de mds1D giststam was verbeterd in verg elijking met tau geïsoleerd uit wild-type gist. Daarentegen was de fosfo rylering van tau in en geïsoleerd uit Pho85-deficiënte gist drastisch ve rhoogd wat resulteerde in sterk verminderde binding aan MT. De geïsoleer de hP-tau/MC1-fractie was niet in staat om aan de MT te binden, en bleek bovendien spontaan te aggregeren, hetgeen deze fractie als zeer patholo gisch karakteriseert. Verrassend was de sterk verhoogde binding van tau- P301L geïsoleerd uit zowel wild-type, als mds1D en pho85< /&gt;D cellen, aan MT, veel sterker dan normaal tau-4R geïsolee rd uit dezelfde gist-stammen. Analyse door atomaire kracht-microscopie t oonde aan dat deze hoge schijnbare binding van tau-P301L voor het groots te deel te wijten was aan aggregatie op het oppervlak van de MT, wat bov endien ook vervorming en bundeling van de MT veroorzaakte. Deze gegevens kunnen de granulaire tau-aggregaten verklaren die gevonden werden in ne uronale uitlopers van tauopathie patiënten. Het nabootsen van de hyper-fosforylering, de conformatie-verandering en de aggregatie van wild-type tau en van FTDP-17 mutant tau in gistcellen liet een analyse toe van de mechanismen die op humaan proteïne tau werkz aam zijn in dit cellulaire model. Bovendien werden fysiologische fosfory lering door specifieke cellulaire kinasen en hun effect op binding aan M t met pathologische conformatie-verandering en aggregatie van proteïne t au, in direct verband gebracht. De isolatie van de unieke hyper-gefosfor yleerde, conformationeel veranderde tau isovorm (hP-tau/MC1) die in staa t is om tau aggregatie te veroorzaken en niet in staat aan MT te binden, is een belangrijke stap in ons fundamenteel onderzoek naar de moleculai re gebeurtenissen die leiden tot tauopathieën.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Department of Human Genetics - miscellaneous
Molecular Physiology of Plants and Micro-organisms Section - miscellaneous
Laboratory of Experimental Genetics and Transgenesis (-)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.