ITEM METADATA RECORD
Title: Study of Molecular Interactions Between Endoxylanases and Their Inhibitors by Phage Display Technology and Mutagenesis
Other Titles: Studie van moleculaire interacties tussen endoxylanasen en hun inhibitoren met behulp van faagdisplay technologie en mutagenese
Authors: Belien, Tim
Issue Date: 20-Feb-2006
Abstract: Endo-ß-1,4-xylanasen (endoxylanasen, EC 3.2.1.8) zijn sleutelenzyme n in de afbraak van xylan, het belangrijkste hemicellulose in de celwand van planten en het op één na meest voorkomende polysacharide op aa rde. Vanuit biotechnologisch standpunt zijn endoxylanasen zeer int eressante enzymen, daar ze een grote impact hebben op de functionaliteit van xylanen in industriële processen omdat ze in staat zijn de interne& nbsp;ß-(1,4) verbindingen van de xylan ruggegraat te hydrolyseren.& nbsp; Echter, niet alleen de uiteenlopende waaier van industriële toepas singen van endoxylanasen (waaronder broodbereiding, gluten/zetmeel-schei ding en de bleking van pulp voor de productie van papier) heeft het onde rzoek op de biochemische en moleculaire aspecten van deze tot de glycosy lhydrolasen klasse behorende enzymen gestimuleerd. Endoxylanasen, in het bijzonder van fungale oorsprong, genieten ook speciale aandacht o mdat ze capabel zijn de celwand van planten af te breken, en hierdoor mo gelijk een voorname rol spelen in fytopathogenese. Een belangrijke ontwikkeling in het onderzoek op endoxylanasen is de ontdekking van end oxylanase-inhibitoren in graangewassen. Vandaag de dag zijn er twe e verschillende types van endoxylanase-inhibitoren beschreven: T riticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI)-type en xylanase inhibitor protein (XIP)-type. De huidige gekende TAXI-type inhibitoren inhi beren alle tot op heden geteste microbiële endoxylanasen van glycosylhyd rolase familie 11, maar niet die van familie 10. XIP-type inh ibitoren, daarentegen, zijn typisch actief tegen fungale familie 10 en 1 1 endoxylanasen, maar niet tegen endoxylanasen van bacteriële oorsprong. Met dit doctoraal onderzoek werd een beter inzicht in de molecula ire interacties tussen endoxylanasen en hun inhibitoren beoogd. Hi ertoe werd een moleculair biologische benadering gevolgd, voornamelijk g ebaseerd op faagdisplay. In een eerste fase werd de XIP-I coderende sequentie, samen met diverse microbiële familie 11 endoxylanase coderende genen, gekloneerd en hetero loog tot expressie gebracht in E. coli. Gekoppeld aan e en opzuiveringsstrategie gebaseerd op Ni-NTA technologie, liet dit ons t oe om deze eiwitten, en ervan afgeleide varianten, in voldoende grote ho eveelheden aan te maken voor daaropvolgende uitgebreide karakteriseringe n. Naast verscheidene reeds beschreven familie 11 endoxylanase gen en, werden ook vier nieuw geïdentificeerde endoxylanase genen van de fyt opathogeen Fusarium graminearum gekloneerd, en kwamen zodoend e ter beschikking voor verder onderzoek. Voor de eerste maal, liet dit toe om endoxylanasen van een fytopathogeen organisme te testen op i nhibitie door endoxylanase inhibitoren. Verrassend genoeg bleek XI P niet in staat beide familie 11 endoxylanasen van F. graminearu m, XylA en XylB, te inhiberen. Verder werd aangetoond dat familie 11 endoxylanasen en hun inhibitoren f unctioneel tot expositie kunnen worden gebracht op de mantel van bacteri ofaag M13. Hiermee samenhangend werden biopanning experimenten op punt gezet opdat selectieve aanrijking tegen geïmmobiliseerde bindingspa rtners verkregen werd. Naast het onderzoek op de toepassing van vo lledige endoxylanasen en endoxylanase-inhibitoren geëxposeerd op filamen teuze bacteriofaagpartikels, werden twee types van faaggeëxposeerde eiwi tfragmentbanken gescreend op de aanwezigheid van specifiek endoxylanaseb indende peptiden. Met als doel de interactieplaats(en) te lokalise ren en het minimum aan moleculaire interacties nodig voor binding te ach terhalen, werd een faaggeëxposeerde Xip-I fragmentenbank gese lecteerd tegen familie 11 endoxylanase. Het feit dat de primair bi ndende lus voornamelijk geselecteerd werd als deel van grotere eiwitfrag menten, duidt op het belang van de driedimensionele conformatie voor de efficiënte bezetting van de katalytische groeve van familie 11 endoxylan asen. Door biopanning van een multivalent faaggeëxposeerde random dodecapeptide bank tegen familie 11 endoxylanasen, konden specifiek endo xylanasebindende peptiden aangerijkt worden, maar geen enkele van hen bl eek in staat de enzymen te inhiberen. In een laatste fase werd het op biopanning gebaseerd selectiesysteem aan gewend om de moleculaire interacties tussen familie 11 endoxylanasen en hun inhibitoren verder in detail te bestuderen. Hiertoe werden uit gebreide combinatorische eiwitbanken van familie 11 endoxylanasen en XIP -I geselecteerd tegen respectievelijk endoxylanase-inhibitoren en endoxy lanasen. Aldoende kon experimenteel aangetoond worden dat de selec tieve moleculaire herkenning van familie 11 endoxylanasen door hun inhib itoren steunt op subtiele sequentieverschillen, en bijgevolg kan beïnvlo ed worden door slechts enkele aminozuursubstituties. Naast de simu ltane evaluatie en experimentele bevestiging van endoxylanase aminozuren verantwoordelijk voor de uiteenlopende inhibitiegevoeligheden, leidde d e hier beschreven combinatorische benadering ook tot de identificatie va n endoxylanasemutanten met een verhoogde inhibitorbindende capaciteit.&n bsp; Op basis van de inzichten verkregen uit de combinatorische analyse, kon het merkwaardig inhibitieprofiel van beide familie 11 endoxylanasen van F. graminearum verklaard worden op moleculair niveau.&nb sp; Daarmee gepaard leverde de mutatie-analyse XylA en XylB mutanten met gewijzigde inhibitiespecificiteiten.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Division of Gene Technology (-)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.