ITEM METADATA RECORD
Title: The use of Saccharomyces cerevisiae as model to study tau-related neurodegenerative diseases
Other Titles: Een cellulair gistmodel voor de fundamentele studie van tau-gerelateerde ziekten.
Authors: Vanhelmont, Thomas
Issue Date: 30-Nov-2007
Abstract: Een belangrijk kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) is het vóórkomen van ‘neurofibrillaire tangles’ (NFT) in de hersenen van patiënten. NFTs bestaan voornamelijk uit ‘paired helical filaments’ (PHF), die op hun beurt weer worden gevormd door tau-proteïnen. In gezonde hersencellen hebben deze proteïnen een microtubuli-stabiliserende functie, maar in de hersenen van Alzheimer patiënten, wordt tau aangetroffen los van de microtubuli in een geaggregeerde vorm. Deze accumulaties blijken een gemeenschappelijk kenmerk te zijn van een aantal neurodegeneratieve aandoeningen, tauopathies genoemd, zoals ‘progressive supranuclear palsy’, corticobasale degeneratie en de ziekte van Pick. De regulatie van tau gebeurt op twee manieren: isovorm-samenstelling en fosforylatie. Beide processen worden gekoppeld aan tauopathies: de zes isovormen van tau-proteïne aggregeren in verschillende mate in elke tauopathie en in al deze aandoeningen wordt tau aangetroffen in een hypergefosforyleerde vorm. Er wordt aangenomen dat de overmatige fosforylatie van tau de oorzaak is of bijdraagt tot hun aggregatie in neuronen en dat dit proces leidt tot de accumulatie van PHFs en NFTs. Deze cascade ontwikkelt zich samen met conformationele veranderingen van tau-proteïnen en mondt uit in het afsterven van neuronen. Hyperfosforylatie is waarschijnlijk het resultaat van de incorrecte werking van kinases en phosphatases en daarom worden deze intensief bestudeerd. De meeste informatie rond tau fosforylatie werd bekomen door middel van in vitro experimenten met gezuiverd recombinant tau, afkomstig van bacteriën en moet nog in vivo worden bevestigd. De connectie tussen tau en neurodegeneratieve ziektes wordt verder bevestigd door enkele genetische aanwijzingen. Gedurende de laatste tien jaar werd in het tau-gen een toenemend aantal mutaties geïdentificeerd, die verantwoordelijk zijn voor de neurodegeneratieve aandoening ‘frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17’ (FTDP-17). Ook al is het exacte achterliggende mechanisme van hun effect niet helemaal opgehelderd, toch tonen deze mutaties onmiskenbaar aan dat de abnormale werking van tau-proteïnen uiteindelijk neurodegeneratie tot gevolg kan hebben. Om de normale en pathologische werking van tau te bestuderen worden een aantal elkaar aanvullende methodes gebruikt zoals in vitro systemen, celmodel systemen en (vaak genetisch aangepaste) modelorganismen. Voor deze thesis hebben we gekozen om de gist Saccharomyces cerevisiae te gebruiken als model om verschillende aspecten van tau-proteïnen te bestuderen. Deze gist, die bekend staat als bakkersgist of biergist, is een eencellig eukaryoot micro-organismen. Het voordeel van deze gist is dat het de mogelijkheid geeft om snelle en relatief goedkope experimenten op te zetten, die door de eukaryote achtergrond toch relevanter zijn dan in vitro-systemen. Doordat er geen homoloog van zoogdier-tau aanwezig is in gistcellen, brachten we proteïne tau heteroloog tot expressie in gist. Immuno-blots met antilichamen, specifiek gericht tegen gefosforyleerde epitopen, kenmerkend voor AD, toonden aan dat diezelfde epitopen gefosforyleerd worden in het gistmodel. Een fractie van de tau-proteïnen werd zelfs aangetroffen in een hypergefosforyleerde vorm. Een groot aantal humane kinasen hebben een homoloog kinase in gist en deze zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor de gefosforyleerde toestand van het tau-proteïne in gist. We toonden ook aan dat tau-proteïnen een pathologische conformatie aannamen in gist en vonden een kleine maar reproduceerbare fractie in een geaggregeerde vorm. De fosforylatie van tau konden we manipuleren door het verwijderen van relevante gist-kinasen. De AD2 en PG5-immunoreactiviteit lag bijvoorbeeld significant lager in een mds1Δ stam, deficiënt in een homoloog van menselijk GSK-3ß, maar kon worden hersteld door co-expressie van menselijk GSK-3ß. Hierdoor kunnen we stellen dat Mds1 in gist en GSK-3ß in mensen de belangrijke kinasen zijn voor deze fosfo-epitopen (S396, S404 en S409). Tau afkomstig van de pho85Δ-mutant, deficiënt in het homoloog van menselijk cdk5, was meer gefosforyleerd op de AD2- en PG5-epitopen en we toonden aan dat deze mutant een toegenomen hypergefosforyleerde taufractie bevat. Verder troffen we in deze pho85Δ mutant 50 maal meer onoplosbaar tau aan dan in ‘wild-type’ of in mds1Δ cellen. We verzamelden ook gegevens die een rol voor Mck1 (een tweede homoloog van menselijk GSK-3ß), PKA en Yak1 (de respectievelijke homologen van menselijk PKA en de familie van Dyrk kinasen) in tau-fosforylatie aantonen en identificeerden de tau-epitopen waar zij een effect op hadden . In een tweede deel van dit werk onderzochten we de eigenschappen van de verschillende isovormen van tau. We benadrukten de rol van het tweede microtubuli-bindend domein van tau in het aggregatieproces, vermits expressie van de kortere 2N/3R tau isovorm, die dit domein niet bezit, resulteert in lagere hoeveelheden sarkosyl-onoplosbaar tau t.o.v. de 2N/4R tau isovorm. We bestudeerden ook de effecten van FTDP-17-mutaties. In ‘wild-type’ cellen leiden deze mutaties tot toegenomen geaggregeerde tau-hoeveelheden. Pho85-deficiëntie verhoogde significant de fosforylatie van C-terminale epitopen in gemuteerd tau, terwijl daarnaast ook de hoeveelheden sarkosyl-onoplosbaar tau (SinT) in deze stammen sterk toenamen. Uitzonderingen waren de FTDP-17 mutanten tau-P301L en tau-R406W, die minder sterk waren gefosforyleerd op S396, S404 en S409 en die minder van de hypergefosforyleerde isovorm produceerden. Deze gegevens suggereren dat sommige FTDP-17-mutaties vérstrekkende conformationele veranderingen in tau kunnen teweegbrengen. Ze geven ook het belang aan van de PG5-epitoop in het aggregatieproces. Dat laatste werd verder bevestigd door het analyseren van synthetische mutanten van deze epitoop. De synthetische tau-S409A mutant kon geen significante hoeveelheid SinT produceren, terwijl zijn pseudo-gefosforyleerde tegenhanger tau-S409E meer of gelijke hoeveelheden SinT als wild-type tau-2N/4R opbracht. Daarnaast veranderden beide synthetische mutanten de fosforylatie op de AD2-epitoop, wat suggereert dat de PG5-epitoop dienst doet als een ‘priming’ locatie voor verdere fosforylatie. Tenslotte stelden we vast dat fosforylatie op de PG5-epitoop ook een belangrijke negatieve determinant is in het microtubuli-tau bindingsproces. In een laatste hoofdstuk onderzochten we de effecten van oxidatieve stress en mitochondriale dysfunctie in ons systeem. Het werd reeds regelmatig gesuggereerd dat beide een effect hebben op tau-proteïnen en een factor zijn in de etiologie van AD en andere tauopathieën. We toonden aan dat ze ook in gist de aggregatie van tau in belangrijke mate beïnvloeden. Behandeling van cellen met ijzerionen zorgde voor een toename in oxidatieve stress en verhoogde de aggregatie van tau in ruime mate. Daarnaast vonden we gelijkaardige hoge hoeveelheden SinT in cellen die kampten met mitochondriale stoornissen. Opvallend genoeg konden we nooit een groei-gerelateerd fenotype detecteren in alle voorgaande stammen en condities, ondanks de grote hoeveelheden SinT, wat suggereert dat tau-aggregatie niet intrinsiek cytotoxisch is. Door een genoomwijde synthetische lethaliteitscreen uit te voeren konden we uiteindelijk twee deletiemutanten identificeren, beiden gekenmerkt door mitochondriale dysfunctie, waarin de expressie van menselijk tau-proteïne resulteerde in groeiproblemen. Dit lijkt er op te wijzen dat mitochondriale dysfunctie niet voldoende zijn voor tau-geïnduceerde toxiciteit, maar mogelijk wel een factor zijn die bijdraagt tot dit proces.Het geheel van gegevens dat werd voorgesteld in deze thesis valideert gist als een modelsysteem dat kan helpen om de fysiologische en pathologische eigenschappen van tau-proteïnen op te helderen. De cascade die leidt tot de filamentvorming en aggregatie van tau en de factoren die dit beïnvloeden, kunnen gekarakteriseerd worden in de stammen die hierboven werden beschreven. Daarnaast kunnen de giststammen worden gebruikt in hoge-doorvoer screenings om genen en drugs te identificeren die interfereren met de tau-afhankelijke pathogenese.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory for Functional Biology (-)
Molecular Physiology of Plants and Micro-organisms Section - miscellaneous

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.