ITEM METADATA RECORD
Title: Arabinoxylan breakdown: structural insights in xylanolytic enzymes and a xylanase inhibitor
Other Titles: Afbraak van arabinoxylaan: structureel inzicht in xylanolytische eiwitten en een xylanase inhibitor
Authors: Vandermarliere, Elien
Issue Date: 30-Oct-2008
Abstract: Arabinoxylaan is het meest voorkomende hemicellulose in de plantencelwand. Het is opgebouwd uit een lineaire hoofdketen van ß-1,4 verbonden xylopyranosyl eenheden. Deze kunnen O-2 en/of O-3 gesubstitueerd zijn met arabinofuranosyl. De afbraak van arabinoxylaan vereist de inwerking van meerdere eiwitten: endo-1,4-ß-xylanasen en ß-xylosidasen verbreken de suikerverbindingen in de hoofdketen en α-L-arabinofuranosidasen verwijderen de arabinofuranosyl eenheden. Deze eiwitten vinden hun weg in verschillende industriële processen terwijl hun substraat en producten vooral voor farmaceutische doeleinden gebruikt worden. Net als voor andere eiwitten vereist optimaal gebruik van xylanolytische eiwitten een gedetailleerde kennis van zowel hun werkingsmechanisme als hun eigenschappen.Alle xylanolytische eiwitten zijn glycosylhydrolasen (GH). Dit is een diverse groep eiwitten die de suikerverbindingen in suikerketens verbreken. Ze zijn onderverdeeld in families gebaseerd op gelijkheden in de aminozuursequentie van hun katalytisch domein. De xylanasen waaraan in deze thesis speciale aandacht besteed wordt behoren tot GH familie 11. Hun structuur wordt vaak beschreven als een half gesloten rechterhand. Bij de aanvang van deze thesis werd een nieuw type xylanase inhibitor opgezuiverd uit tarwe: TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor). Tevens werd in Bacillus subtilis een arabinofuranosidase dat behoort tot GH familie 43 geïdentificeerd. Dit eiwit verwijdert enkel arabinofuranosyl eenheden van O-2 of O-3 monogesubstitueerde xylose eenheden van arabinoxylaan. Dit resulteerde in de naam arabinoxylaan arabinofuranohydrolase-m2,3 (AXH-m2,3).Biochemische analyse van bovenstaande eiwitten werd uitgevoerd door de laboratoria voor Gentechnologie en Voedingschemie en Biochemie. In deze thesis ligt de focus op de structurele analyse van eiwitten die belangrijk zijn bij de afbraak van arabinoxylaan en speciale aandacht wordt besteed aan hun interactie met AXOS. Deze kennis zal ons in staat stellen om nieuwe eiwitten te ontwikkelen wat op zijn beurt kan leiden tot de vorming van specifieke producten. Om inzicht te krijgen in de structuur van de xylanolytische eiwitten werd gebruik gemaakt van kristallografie. X-stralendiffractie door monokristallen is een zeer nauwkeurige techniek om de structuur van eiwitten en eiwit-substraat complexen te analyseren. Voor GH familie 11 xylanasen werd enkel de binding van xylose eenheden in de glycon subsites kristallografisch gekarakteriseerd terwijl karakterisatie van de aglycon subsites gebaseerd is op modelling. Om ook de aglycon subsites kristallografisch te karakteriseren werd van zowel Bacillus subtilis xylanase als van Aspergillus niger xylanase een inactieve mutant aangemaakt. Vervolgens werden xylo-oligosacchariden in kristallen van de inactieve mutanten geïntroduceerd waarna de structuur van de complexen opgelost werd. Voor beide xylanasen was duidelijke elektronendensiteit voor xylose eenheden in de -1 en -2 subsites aanwezig. Bovendien was er voor het B. subtilis xylanase eveneens densiteit voor xylose eenheden in de -3 and +1 subsites. Dit was de eerste maal dat substraat dat de -1 en +1 subsites overspant waargenomen werd. Met behulp van deze resultaten en de observatie dat bepaalde aminozuren uit de aglycon subsites een verschillende conformatie aannemen bij substraatbinding konden de aminozuren belangrijk voor substraatbinding in de aglycon subsites geïdentificeerd worden. Daarnaast werd voor beide xylanasen een tweede onproductieve ligandbindingsplaats aan de oppervlakte van het eiwit gevonden. Deze extra bindingsplaats heeft waarschijnlijk een functie analoog met die van de aparte carbohydraatbindende domeinen bij andere GH families, namelijk het verhogen van de effectieve concentratie van het katalytisch centrum nabij polymeer substraat.Vervolgens werd de structuur van de B. subtilis xylanase D11F/R122D dubbel mutant bepaald. Deze mutant is ongevoelig voor de inhibitie door TAXI, een xylanase inhibitor uit tarwe. Deze structuur vertoonde een uitgestrekte conformatie van de duimregio. Deze conformatie speelt waarschijnlijk een belangrijke functie bij het vrijlaten van product. Na hydrolyse neemt de duim heel vlug zijn uitgestrekte conformatie aan. Tijdens deze beweging wordt het product uit het katalytisch centrum gekatapulteerd met behulp van de isoleucine die zich op de tip van de duimregio bevindt. In een ander deel van deze thesis wordt de structuur van de inactieve H22A TLXI mutant beschreven. TLXI werd geïdentificeerd als een niet-competitieve inhibitor van xylanase met een aminozuursequentie analoog met die van thaumatine-achtige eiwitten. De structuur van TLXI lijkt heel sterk op de basisstructuur van thaumatine. Enkel domein II van thaumatine ontbreekt bij TLXI. Daarom behoort TLXI tot de subfamilie van kleine thaumatine-achtige eiwitten en is het tevens het eerste eiwit van deze familie dat kristallografisch gekarakteriseerd werd. Naast TLXI bevat deze subfamilie ook thaumatine-achtige eiwitten uit gerst. Histidine 22 werd met behulp van plaatsgerichte mutaties geïdentificeerd als een sleutelresidu nodig bij de inhibitie van GH familie 11 xylanasen. Dit aminozuur bevindt zich in een lus die bij andere thaumatine-achtige eiwitten ofwel veel korter is ofwel een andere positie inneemt. Daarom is waarschijnlijk niet enkel histidine 22 maar de ganse lus belangrijk bij inhibitie door TLXI. In het laatste deel van deze thesis werd de structuur van AXH-m2,3 uit B. subtilis bepaald (BsAXH-m2,3). Dit eiwit bestaat uit twee domeinen: een katalytisch domein met de structuur van een ß-propeller bestaande uit 5 rotors, en een carbohydraatbindend domein bestaande uit een ß-sandwich behorende tot CBM familie 6. Verschillende carbohydraten werden in BsAXH-m2,3 kristallen geïntroduceerd. Aan de hand hiervan kon inzicht verkregen worden in de binding van substraat en konden de katalytische aminozuren geïdentificeerd worden. Deze zijn de algemene base AspAXH 24, het algemene zuur GluAXH 225 en AspAXH 163. Dit laatste aminozuur speelt een rol bij de pKa modulatie van GluAXH 225 en de correcte oriëntatie van zowel GluAXH 225 als het substraat. De katalytische aminozuren bevinden zich in een holte naast een groeve waarin de xylaanhoofdketen bindt. Deze schikking is heel geschikt voor het verwijderen van de arabinose substituenten. De xylaanhoofdketen bindt vooral door middel van hydrofobe stapelinteracties aan BsAXH-m2,3. Deze manier van binden biedt waarschijnlijk de vrijheid nodig om de te verbreken suikerverbinding correct te positioneren ten opzichte van de katalytische aminozuren.Geen enkele van de carbohydraten die geïntroduceerd werden in de BsAXH-m2,3 kristallen bleken aan het CBM te binden. Dit kan op basis van de structuur verklaard worden. In groeve A ontbreken de aromatische aminozuren die belangrijk zijn bij de binding van de suikers en groeve B is geblokkeerd door een lus.Vergelijking van BsAXH-m2,3 dat substituenten verwijdert en twee andere GH familie 43 leden met exo activiteit verraadt een verschillend mechanisme tijdens de binding van substraat. De Na superpositie van de respectievelijke eiwitten met hun gebonden substraat, blijkt de oriëntatie van de substraathoofdketens loodrecht op elkaar gepositioneerd te zijn. Dit verschil in binding is noodzakelijk om hun verschillende functies activiteit te verklaren vermits leden van dezelfde GH familie hun katalytische aminozuren op dezelfde positie hebben.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Biocrystallography

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.