ITEM METADATA RECORD
Title: Antiviral resistance development against inhibitors of HIV-1integration
Other Titles: Antivirale resistentie ontwikkeling tegen inhibitoren van HIV-1 integratie
Authors: Hombrouck, Anneleen; S0033432
Issue Date: 20-Dec-2007
Abstract: Sinds de identificatie van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) als het oorzakelijk agens van AIDS in 1983, werden aanzienlijke vorderingen geboekt in de behandeling van deze infectie. Desondanks werd door de wereldgezondheidsorganisatie het aantal HIV geïnfecteerden in december 2006 geschat op 39.5 miljoen mensen. Vandaag de dag bestaat de therapie voor HIV-geïnfecteerden uit een combinatie van antiretrovirale middelen gericht tegen virus fusie, of de virale enzymen reverse transcriptase (RT) en protease (PRO). Deze combinatietherapie, HAART (‘highly active antiretroviral therapy’) genaamd, is echter niet in staat om het virus volledig uit te roeien. Bovendien bezit HIV een grote genetische flexibiliteit, waardoor virusstammen geselecteerd worden die (multi)resistentie vertonen tegen de momenteel beschikbare inhibitoren en zo het klinische succes van de huidige therapie beperken. Voor geïnfecteerde patiënten zijn HIV remmers momenteel de enige optie. Resistentie-ontwikkeling vormt dus een groot probleem en vraagt een directe, concrete en gerichte aanpak. Deze bestaat enerzijds uit het ontwikkelen van nieuwe antivirale middelen, zowel tegen bestaande als tegen nieuwe doelwitten, zoals de integratie van het viraal genoom in het gastheer genoom. Dit is een belangrijke stap in de HIV replicatiecyclus die wordt gekatalyseerd door het enzym integrase (IN). Bijgevolg is integratie een zeer beloftevol doelwit voor nieuwe anti-HIV therapie. Anderzijds moeten we de huidige resistentieproblematiek beter leren begrijpen en beheersen en een plaats geven binnen therapiemanagement.Meer dan 12 jaar onderzoek werd verricht vooraleer de eerste klinisch bruikbare IN inhibitoren werden geïdentificeerd. Een groot aantal middelen inhiberen IN activiteit in een geïsoleerde enzymatische test. In celcultuur vertonen de meeste van deze middelen echter geen anti-HIV activiteit of een hoge cytotoxiciteit. De identificatie van een serie diketozuren (DKZ) die specifiek de IN strand transfer stap inhiberen (INSTI’s) en zo virale replicatie blokkeren, leverde het eerste conceptueel bewijs van HIV IN inhibitoren als antivirale middelen. Recent werd de eerste IN inhibitor goedgekeurd worden voor de behandeling van HIV patiënten. Onlangs werd een tweede groep potentiële IN inhibitoren geïdentificeerd in ons laboratorium, namelijk de pyranodipyrimidines (PDP’s). Deze antivirale middelen werken in op de binding van IN aan het virale DNA, met V-165 als krachtigste vertegenwoordiger.Hoewel het virale IN de hoofdrolspeler is in HIV integratie, zijn ook cellulaire proteïnen nodig in het integratieproces. Deze worden cellulaire cofactoren genoemd. Deze virus-gastheer interacties vormen op hun beurt aantrekkelijke nieuwe doelwitten voor anti-HIV therapie. In ons laboratorium werd aangetoond dat de transcriptionele co-activator LEDGF/p75 een bindingspartner van HIV-1 IN is. Verder onderzoek bevestigde dat LEDGF/p75 een belangrijke rol heeft tijdens HIV replicatie. Deze doctoraatsthesis behandelt de volgende objectieven: (1) De validatie en verificatie van antivirale doelwitten van nieuwe potentiële HIV integratie inhibitoren, gebruik makende van in vitro antivirale resistentie ontwikkeling. (2) De studie van in vitro resistentie tegen inhibitoren van HIV integratie, om toekomstige in vivo resistentie in patiënten die een therapie volgen gebaseerd op inhibitoren behorende tot deze klasse beter te begrijpen en voorspellen. In een eerste studie werd antivirale resistentie-ontwikkeling onderzocht tegenover V-165, als onderdeel van preklinische studies met PDP. De studie toonde de accumulatie van mutaties ter hoogte van het IN gen, maar ook in het enveloppe en het RT gen. Sommige van deze RT en enveloppe mutaties werden al eerder beschreven als zijnde geassocieerd met HIV resistentie tegen respectievelijk RT en opname inhibitoren. Vervolgens onderzochten we de rol van elke set mutaties in het geobserveerde fenotypische profiel met behulp van chimere virus technologie. Recombinatie van elk van de gemuteerde RT, env of IN genen alleen in een wild type achtergrond bleek het fenotypische resistentieprofiel van de parentale geselecteerde HIV stam tegenover V-165 niet te reproduceren. Waarschijnlijk spelen de geselecteerde mutaties in RT, IN en env ieder een gedeeltelijke rol in in vitro resistentie ontwikkeling tegenover V-165. Deze observaties leidden tot onze hypothese dat V-165 mogelijk een multimodaal werkingsmechanisme heeft, waarbij de drug inwerkt op integratie, en/of reverse transcriptie en/of virale opname. Verdere experimenten bevestigden deze hypothese. Hoewel V-165 HIV-1 integratie inhibeert in celcultuur, zoals we konden aantonen met behulp van een Q-PCR analyse na VSV-G gepseudotypeerde HIV-1 infectie, inhibeert het product ook de HIV-1 opnamestap aan een concentratie van 19 µM. Experimenten die de farmacokinetische eigenschappen van V-165 onderzochten, toonden aan dat de drug makkelijk aan (aspecifieke) proteïnen bindt. Dit is mogelijk de reden van de meer aspecifieke effecten van V-165 tijdens verschillende stappen in de HIV levenscyclus. Deze data illustreren nogmaals het nut van het bestuderen van antivirale resistentie-ontwikkeling om de doelwitstappen van een (experimenteel) geneesmiddel te bepalen. Recent werd LEDGF/p75 gevalideerd als een belangrijke cofactor van HIV-1 integratie en replicatie. De cellulaire factor functioneert als een linker tussen het virale IN en het gastheer genoom. IN interageert met LEDGF/p75 ter hoogte van het IN bindingsdomein (IBD) in het C-terminaal domein van het cellulaire proteïne. In cellen die dit C-terminaal fragment van LEDGF/p75 tot overexpressie brengen is HIV replicatie sterk geïnhibeerd. Deze fragmenten bezitten namelijk niet de N-terminaal gelegen chromatine bindende domeinen, waardoor ze disfunctioneel zijn voor het linken van IN met het gastheer genoom. De C-terminale LEDGF/p75 fragmenten treden in competitie met endogeen LEDGF/p75 voor de binding met IN, waardoor het integratieproces sterk wordt geremd. In een tweede deel van deze doctoraatsthesis onderzochten we of en hoe HIV kan ontsnappen aan inhibitoren van deze eiwit-eiwit interactie, door HIV repetitief te cultiveren in cellen die het gehele C-terminaal deel van LEDGF/p75 tot overexpressie brengen. Via de selectie van twee mutaties (A128T en E170G) op kritische posities in de interactieregio tussen LEDGF/p75 en HIV IN bevestigde het virus zelf de cruciale rol van LEDGF/p75 in HIV replicatie. Naast het gebruik van een originele aanpak voor de studie van gastheer-virus interacties, verkregen we ook bijkomende informatie over de LEDGF/p75-IN interactie en het therapeutisch potentieel om deze interactie te remmen. Hoewel het dubbel mutant A128T/E170G virus in staat was om te vermenigvuldigen in cellen die inhiberende C-terminale fragmenten van LEDGF/p75 tot overexpressie brengen, konden de enkelvoudige mutante virussen A128T en E170G dit resistentieprofiel slechts gedeeltelijk reproduceren. Blijkbaar zijn beide mutaties nodig voor het resistentieprofiel. Dit suggereert dat mogelijks twee IN mutaties nodig zullen zijn om de therapeutische werking van potentiële inhibitoren van deze eiwit-eiwit interactie te trotseren. De IN mutaties waren ook geassocieerd met een verminderde affiniteit voor de cofactor en een verminderde enzymatische activiteit en replicatiecapaciteit. Verdere experimenten naar het onderliggende resistentiemechanisme konden geen bewijs leveren dat het virus onafhankelijk van LEDGF/p75 repliceert. Integendeel, het virus discrimineerde tussen het inhiberend C-terminaal fragment en de cofactor door middel van affiniteitsverschillen. Verhoogde selectieve druk op de IN-LEDGF/p75 interactie (hier voorgesteld door overexpressie van C-terminale fragmenten van LEDGF/p75) selecteert blijkbaar niet voor een alternatieve vervanger. Dit suggereert dat LEDGF/p75 een exclusieve rol heeft tijdens HIV-1 replicatie. Deze data bevestigen tevens het potentieel en de aantrekkelijkheid van de LEDGF/p75 IN interactie als doelwit voor innovatieve antivirale therapie. In een derde studie onderzochten we antivirale resistentie ontwikkeling tegen de klasse IN inhibitoren welke momenteel in klinische ontwikkeling is, met name de IN strand transfer inhibitoren (INSTI’s). Meer specifiek onderzochten we in vitro resistentie tegen de naphthyridine L-870,810. Hoewel deze remmer momenteel niet meer in klinische ontwikkeling is, kunnen we met deze studie toch belangrijke inzichten verwerven in de mutationele patronen en mechanismen van HIV-1 (kruis)resistentie in deze nieuwe klasse IN strand transfer inhibitoren. De verkregen data wijzen op aspecten die gemeenschappelijk blijken te zijn in HIV resistentie tegen INSTI’s, met name de relatief langzame (3 tot 6 maanden) ontwikkeling van resistentie tegen INSTI’s in vitro, de selectie van meerder mutaties ter hoogte van het katalytische gebied in IN en de observatie dat de meeste IN mutaties geassocieerd met resistentie een invloed hebben op de enzymatische activiteit en virale replicatiecapaciteit. Bovendien suggereert de studie dat kruisresistentie tussen de huidige INSTI’s waarschijnlijk zal voorkomen en mogelijks het therapeutische gebruik van deze inhibitoren kan beperken. Deze observaties bevestigen de behoefte aan een tweede generatie IN inhibitoren, met een verhoogde genetische barrière en beperkte kruisresistentie. Deze antivirale middelen kunnen inwerken op de strand transfer stap of alternatieve stappen tijdens het integratieproces. In deze context zijn onze data betreffende V-165, L-870,810 en LEDGF/p75 ook interessant voor de ontwikkeling van tweede generatie remmers. De L-870,810 studie vergroot de poel aan IN mutanten die kunnen gebruikt worden tijdens het screenen naar nieuwe, krachtige tweede generatie INSTI’s. Hoewel de in vitro resistentie studie van V-165 erop wijst dat V-165 mogelijks een multimodaal werkingsmechanisme heeft in celcultuur, kan de drug nog steeds beschouwd worden als het prototype van IN bindingsinhibitoren (INBI’s) als antivirale middelen. Verdere optimalisatie kan aanleiding geven tot meer selectieve remmers met betere farmacokinetische eigenschappen. Ook onze data over LEDGF/p75 suggereren dat de LEDGF/p75-IN interactie een goed antiviraal doelwit is voor de ontwikkeling van tweede generatie anti-IN therapie.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Molecular Virology and Gene Therapy
Faculty of Medicine, Campus Kulak Kortrijk

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.