ITEM METADATA RECORD
Title: Hantaviruses: classification, diagnosis and prevention
Other Titles: Hantavirussen: classificatie, diagnose en preventie
Authors: Maes, Piet
Issue Date: 21-Dec-2007
Abstract: Hantavirussen zijn wereldwijd verspreid. Knaagdieren en spitsmuizen sturen deze enkelstrengige RNA-virussen de wereld in met twee heel ernstige aandoeningen in hun kielzog: hemorragische koorts met niersyndroom (vooral in Azië en Europa) en het hantavirus longsyndroom (vooral in Noord- en Zuid-Amerika). De infectie wordt bij de mens veroorzaakt door contact met geïnfecteerde knaagdieren of hun uitwerpselen. De geïnfecteerde dieren zijn zelf geen slachtoffers van het virus maar ze kunnen wel een erg dodelijk spoor achterlaten. Men kent vandaag 22 soorten hantavirussen. Deze classificatie gebeurt op basis van vier basiscriteria vastgelegd door het ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses). Dergelijke classificatie is een essentieel hulpmiddel bij de ontwikkeling van vaccins en antivirale therapieën. Onderzoekers moeten voor hun regio immers precies weten met welk soort virus zij te kampen hebben om het juiste vaccin en de juiste therapie te kunnen ontwikkelen. In concrete situaties is de ICTV-classificatie helaas moeilijk toe te passen. Ze wordt dan ook zelden gebruikt bij de identificatie van nieuwe soorten hantavirussen. Precies daarom werd, in een eerste deel van deze studie, gezocht naar een nieuwe, op similariteit gebaseerde classificatie naast die van het ICTV. We analyseerden hiervoor alle bestaande en volledige sequenties van de hantavirus S-, M- en L-segmenten, meer bepaald via similariteits- en fylogenetische analyses (maximum likelihood en neighbor-joining analyses). Dankzij de hantavirus S-segment sequenties, kwamen wij tot een duidelijker onderscheid tussen de verschillende soorten hantavirussen. Wij stellen dan ook voor om de tweede regel van de ICTV-clas-sificatierichtlijnen (een minimum verschil van 7% in aminozuuridentiteit in vergelijking met de volledige hantavirus S- en M-segmenten), aan de huidige situatie aan te passen. Die tweede regel wordt dan: “een minimum verschil van 10% in S-segment similariteit of een minimum verschil van 12% in M-segment similariteit”. Deze gewijzigde richtlijn kan bovendien ook worden gebruikt om hantavirussen voorlopig te classificeren tot de neutralisatietesten betere resultaten genereren. Voor hantavirussen die zonder isolaat worden ontdekt, waardoor geen neutralisatietesten kunnen worden uitgevoerd, kan deze wijziging een alternatief bieden voor een correcte identificatie. Om die identificatie nog te vereenvoudigen, hebben wij een webtoepassing ontwikkeld, gebaseerd op S-segment sequenties. Deze webtoepassing (met Java en Perl-scripts) combineert fylogenetische analyse met similariteitsvergelijking voor de classificatie van hantavirussen. Analyses met perfect gedefinieerde hantavirussequenties hebben overigens aangetoond dat onze webtoepassing deze sequenties perfect classificeert.In Europa zijn vooral het Dobrava-Belgrade virus en het Puumala virus bij mensen oorzaak van hemorragische koorts met niersyndroom. Omdat hantavirussen infecties met hoge morbiditeit en mortaliteit veroorzaken, en gezien men hiervoor momenteel geen specifieke behandeling kent, zijn de onderzoeksinspanningen geconcentreerd op de ontwikkeling van vaccins en antivirale therapie. In een tweede deel van dit doctoraatsproject wordt de immunologische respons onderzocht in NMRI-muizen die behandeld werden met verschillende recombinante proteïnen, afgeleid van het S-segment nucleocapside van het Dobrava-Belgrade virus en het Puumala virus. Sommige van deze proteïnen bevatten het membraanproteïne A van Klebsiella pneumoniae, ook wel rP40 genoemd. Deze molecule vergemakkelijkt de opname van exogene antigenen door dendritische cellen en doet dienst als adjuvant. De verschillende Dobrava-Belgrade virus en Puumala virus recombinante proteïnen werden gekloneerd en tot expressie gebracht in de E. coli mutant ICONE 200 via een tryptofaanpromotor-gecontroleerde pTEXmp18 expressievector. Om de immunogeniciteit van deze recombinante proteïnen te testen, werd een ELISA ontwikkeld gebaseerd op Dob118 en Puu118, twee proteïnen bestaande uit de eerste 118 amino-terminale aminozuren van respectievelijk het Dobrava-Belgrade virus en het Puumala virus S-segment. Via deze ELISA’s kon worden aangetoond dat alle geteste recombinante proteïnen een sterke immunologische reactie veroorzaakten na 3 vaccinaties met 10 µg proteïne. Deze vaccinaties resulteerden in de inductie van een sterke nucleocapside-specifieke IgG reactie met een overheersing van IgG1 over IgG2b en IgG2a isotype. Een specifieke IgG3 isotype reactie werd niet waargenomen. De NMRI-muizen gevaccineerd met de recombinante proteïnen zonder het rP40 proteïne, vertoonden lagere titers van nucleocapside-specifieke antilichamen in vergelijking met de proteïnen die wel rP40 bevatten.Hoewel verscheidene soorten knaagdieren, konijnen en niet-humane primaten met het Dobrava-Belgrade virus of het Puumala virus geïnfecteerd kunnen worden, vertonen enkel mensen symptomen van hemorragische koorts met niersyndroom. Om het beschermende effect van de verschillende recombinante proteïnen na te gaan, werd gebruik gemaakt van een NMRI-muismodel. Infectie in dit NMRI-model wordt bevestigd door middel van de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen. In onze experimenten werden neutraliserende antilichamen gedetecteerd dankzij een nieuwe techniek, de replication reduction neutralization test (RRNT). Met deze test wordt de reductiegraad van het virus na incubatie met serum bepaald door middel van een kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR). In de infectie-experimenten gaven enkel de proteïnen bestaande uit de eerste 118 N-terminale aminozuren gekoppeld aan rP40 (P40-Dob118, P40p-Dob118 en P40-Puu118) 100% bescherming en dit na 3 vaccinaties met 10 µg proteïne. Deze resultaten suggereren dat deze recombinante proteïnen goede kandidaten zijn voor een recombinant subunit vaccin gericht tegen het Dobrava-Belgrade virus en het Puumala virus.In het laatste deel van deze studie, bestuderen we chloroquine, een 4-aminoquinoline, als efficiënte inhibitor van de replicatie van het hantavirus in vitro en in vivo. Chloroquine, een klinisch goedgekeurd middel tegen malaria, werd in vitro getest in Vero E6 celcultuur met verscheidene Nieuwe en Oude Wereld hantavirussen. De resultaten wijzen erop dat de IC50 van chloroquine voor antivirale activiteit (10,2 ± 1,43 µM) beduidend lager is dan zijn cytotoxische activiteit, CC50 (260 ± 2,52 µM), wat een selectiviteitsindex van 25,5 opbrengt. In de in vivo experimenten met pasgeboren C57Bl/6-muizen, werd na infectie de hoogste overleving waargenomen (72,7%) bij muizen dagelijks behandeld met 10 mg/kg chloroquine. De overleving van de pasgeboren C56Bl/6-muizen daalde op een dosisafhankelijke wijze, met 47,6% overleving bij een dagelijkse behandeling met 5 mg/kg chloroquine, met 4,2% overleving wanneer er dagelijks werd behandeld met 1 mg/kg. Onze resultaten tonen aan dat chloroquine heel efficiënt is tegen hantavirusinfectie bij pasgeboren C57Bl/6-muizen en als toekomstig preventief middel tegen hantavirussen kan worden beschouwd.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Clinical and Epidemiological Virology (Rega Institute)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.