ITEM METADATA RECORD
Title: Mechanisms involved in the desensitization of the motilin receptor
Other Titles: Mechanismen betrokken bij de desensitisatie van de motiline receptor
Authors: Mitselos, Anna; M0119935
Issue Date: 11-Mar-2008
Abstract: De motiline receptor (MTLR) is een aantrekkelijk therapeutisch doelwit voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die gebruikt kunnen worden voor de behandeling van functionele gastro-intestinale (GI) motiliteitsstoornissen. Motiline is een GI-hormoon dat contracties veroorzaakt tijdens de nuchtere toestand die ontstaan in de maag en distaalwaarts migreren om het spijsverteringkanaal van voedselresten te reinigen. Bovendien versnelt motiline de maaglediging in de gevoede toestand. Geneesmiddelen zoals de motilides, erythromycine derivaten die het effect van motiline nabootsen, vertegenwoordigen een klasse van potentieel bruikbare prokinetische middelen voor de behandeling van GI-hypomotiliteitsstoornissen. De negatieve resultaten bekomen in klinische studies met het meest belovende motilide, ABT-229, voor de behandeling van patiënten met functionele dyspepsie en diabetisch gastroparese wezen erop dat, uit een aantal factoren, desensitisatie aan de basis zou kunnen liggen voor het gebrek aan symptoomverbetering in deze patiënten (Tack en Peeters, 2001). In feite toonden in vitro studies aan dat ABT-229 ongewoon sterk desensitiserende eigenschappen heeft in vergelijking met wat kan verwacht worden op basis van zijn activiteit (Thielemans et al., 2005).De mechanismen die betrokken zijn bij het desensitisatieproces van de MTLR na agoniststimulatie zijn nog niet helemaal opgehelderd maar zijn cruciaal voor de ontwikkeling van motiline agonisten met een aanhoudende doeltreffendheid. Om de ongewoon sterke desensitiserende eigenschappen van ABT-229 op te helderen hebben we de moleculaire en cellulaire wegen betrokken in de intracellulaire signaalweg van de MTLR vergeleken na blootstelling aan ofwel ABT-229, motiline of erythromycine-A (EM-A). Als cellulair model hebben we gebruik gemaakt van een Chinese Hamster Ovarium (CHO) cellijn die de MTLR of de MTLR C-terminaal gemerkt met een groen fluorescent proteïne (MTLR-EGFP) en de Ca2+-indicator apoaequorine tot expressie brengt. We hebben aangetoond dat de verschillen in MTLR desensitisatie na stimulatie met motiline, EM-A en ABT-229 te wijten zijn aan alternatieve signaalwegen van de receptor. Fosforylatie is één van de eerste stappen in het desensitisatieproces. Na stimulatie met motiline of EM-A gebeurt de fosforylatie van de MTLR vermoedelijk via G-proteïne gekoppelde receptor kinases terwijl voor ABT-229 de fosforylatie ook proteïne kinase C afhankelijk is. De gefosforyleerde MTLR recruteert ß-arrestine-2 met een grotere affiniteit dan ß-arrestine-1 en brengt vervolgens de receptor naar vesikels met een clathrinemantel. De ß-arrestines dissociëren van de MTLR aan het plasmamembraan alvorens de receptor geïnternaliseerd wordt, wat erop wijst dat de MTLR tot de klasse A van de familie van recyclerende receptoren behoort. Het ligand-receptor complex wordt vervolgens gesorteerd in endosomen, die de MTLR terug naar de plasmamembraan vervoeren. Internalisatie en resensitisatie van de receptor zijn agonistafhankelijk en de ongewoon sterk desensitiserende eigenschappen van ABT-229 zijn niet gerelateerd aan een hogere graad van receptorfosforylatie, noch aan een verandering in ß-arrestine binding of internalisatiekinetica, maar aan een hogere graad van internalisatie en een tragere recyclage van de MTLR naar de plasmamembraan.Naast de ontwikkeling van krachtige erythromycinederivaten, is er ook interesse in de ontwikkeling van stabiele motiline fragmenten. Omdat desensitisatie van de MTLR zijn biologische activiteit beperkt, hebben we de structurele eigenschappen van motiline onderzocht die belangrijk zijn voor desensitisatie. De bio-activiteit van motiline zit verscholen in de N-terminale regio aangezien volledige activiteit kan verkregen worden met een verkort peptide met een lengte van 14 in plaats van 22 aminozuren (Macielag et al., 1992; Peeters et al., 1992). Motiline [1-14] daarentegen is niet in staat om desensitisatie te induceren maar C-terminale verlenging van motiline bevordert de desensitisatie. Om de scheiding tussen de N-terminale activatie en de C-terminale desensitisatie te bevestigen hebben we het vermogen onderzocht van volledige motiline agonisten, partiële agonisten en antagonisten van verschillende fragmentlengte om desensitisatie te induceren van de MTLR die tot expressie is gebracht in CHO-cellen. Veranderingen in de N-terminale regio van motiline [1-22] en [1-14] door vervanging van Pro3 door Phe3 vermindert aanzienlijk de bio-activiteit maar beïnvloedt in mindere mate de desensitisatie. Verkorting van motiline tot fragmenten van 4 (GM-109) of 3 (MA-2029) aminozuren resulteert in inactieve stoffen met antagonistische eigenschappen die de receptor niet desensitiseren. De fragmenten Phe3[1-14], GM-109 and MA-2029 die niet desensitiseren, veroorzaken geen of in mindere mate fosforylatie van de receptor en internaliseren ook bijgevolg de receptor niet. De desensitisatie geïnduceerd door de partiële agonist, Phe3[1-22], daarentegen gebeurt onafhankelijk van receptor fosforylatie en internalisatie. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat de N-terminus van motiline verantwoordelijk is voor activatie en binding en dat de C-terminus een conformatieverandering teweegbrengt die deze binding stabiliseert en hierdoor ook de receptor gevoeliger maakt voor fosforylatie en internalisatie en desensitisatie. Bovendien bevorderen veranderingen aan de N-terminus zoals in Phe3[1-22] een conformatie van de receptor die minder gevoelig is voor fosforylatie en internalisatie maar die wel nog desensitisatie van de motiline receptor induceert.Kennis van de receptordomeinen van de MTLR die betrokken zijn in het desensitisatieproces zou belangrijke informatie kunnen leveren voor de ontwikkeling van motiline agonisten met verminderde desensitiserende eigenschappen. Voor vele G-proteïne gekoppelde receptoren zijn agonist geïnduceerde fosforylatie van serine en threonine residuÂ’s in de C-terminale staart cruciaal voor receptor desensitisatie. Daarom werd de rol van de C-terminale staart van de MTLR in het desensitisatieproces bestudeerd. Truncatiemutagenese toonde aan dat MTLR desensitisatie en internalisatie niet afhankelijk zijn van de aanwezigheid van de C-terminale staart. Truncatie van de receptor tot aminozuur 385 (MTLTΔ385-EGFP mutant) of verdere truncatie tot aminozuur 375 (MTLTΔ375-EGFP mutant) beïnvloedt de internalisatie niet, terwijl de fosforylatie respectievelijk gereduceerd wordt tot 80% of niet beïnvloed wordt. Deze resultaten suggereren dat het verwijderen van belangrijke fosforylatieplaatsen in de C-terminale staart door C-terminale truncatie de internalisatie bevordert via fosforylatie-onafhankelijke signaalwegen of via fosforylatie van alternatieve plaatsen in de receptor. Verder hebben we ook een dileucine-gebaseerd motief (Leu369-Leu370-Leu371) geïdentificeerd in de C-terminale staart van de MTLR dat noodzakelijk blijkt te zijn voor het correct tot expressie brengen van de receptor aan de celmembraan. Bovendien resulteert truncatie van de receptor van aminozuur 385 tot 375 in een mutant met een minder efficiënte Ca2+-respons, wat erop wijst dat deze regio betrokken blijkt te zijn in G-proteïne koppeling.Tot slot, onze data onthullen belangrijke inzichten in de mechanismen die betrokken zijn in MTLR desensitisatie. Dit kan nuttige informatie leveren die als hulp kan dienen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen met aanhoudende doeltreffendheid voor de behandeling van functionele GI-motiliteitsstoornissen.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Translational Research in GastroIntestinal Disorders

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.