ITEM METADATA RECORD
Title: Novel strategies to inhibit enterovirus replication
Other Titles: Nieuwe strategieën voor de inhibitie van enterovirus replicatie
Authors: De Palma, Armando
Issue Date: 21-May-2008
Abstract: Picornavirussen vormen een grote, wijdverspreide virusfamilie die ingedeeld wordt in negen genera. In de humane geneeskunde zijn entero- en rhinovirussen de twee meest relevante genera. Rhinovirussen zijn de belangrijkste oorzaak van verkoudheden en hoewel meestal niet levensbedreigend, hebben ze een enorme socio-economische impact (verloren school- en werkdagen). Daarenboven wijzen meer en meer studies erop dat rhinovirussen betrokken zijn bij opflakkeringen van asthma en “chronic obstructive pulmonary disease” (COPD). Er wordt voorspeld dat COPD tegen 2020 wereldwijd de derde belangrijkste doodsoorzaak zal zijn. Ook coxsackievirussen (genus enterovirus) zijn belangrijke humane pathogenen, voornamelijk in de pediatrie, waar ze kunnen leiden tot “hand-foot-mouth disease”, herpangina, rash en meer levensbedreigende aandoeningen zoals pancreatitis, myocarditis, encephalitis en meningitis. Poliovirus behoort eveneens tot de enterovirussen en was tot voor enkele decennia verantwoordelijk voor vele gevallen van poliomyelitis. Ondanks het feit dat polio tegenwoordig in het Westen niet meer voorkomt, vormt dit virus nog steeds een bedreiging voor een aantal Afrikaanse en Aziatische landen waar het endemisch blijft. De wereldwijde eradicatie van polio die oorspronkelijk gepland was voor het jaar 2000 is dan ook nog veraf. Naast entero- en rhinovirussen omvat de picornavirus familie nog verschillende andere pathogenen voor mens en dier, waaronder het hepatitis A virus en het mond-en-klauwzeervirus.Ondanks de enorme impact van picornavirussen op de volksgezondheid bestaat er nog steeds geen therapie voor de behandeling van infecties met deze virussen. Voorheen werden er verschillende selectieve inhibitoren van de replicatie van picornavirussen gerapporteerd. De meeste van deze moleculen hebben het virale capside of het virale protease als moleculair doelwit. Ondanks het feit dat een aantal van deze moleculen werd geëvalueerd in klinische studies, werd geen enkel molecule uiteindelijk klinisch ontwikkeld. Op dit moment worden de werkzaamheid en de veiligheid van twee moleculen bestudeerd in fase 2 klinische studies: pleconaril (Schering-Plough) en BTA-798 (Biota holdings). Beide worden nu ontwikkeld voor de behandeling van rhinovirus infecties in asthma- en COPD risicopatiënten.Vanuit het idee om nieuwe inzichten te verwerven in mogelijke doelwitten voor de inhibitie van enterovirus replicatie, werden “lead” moleculen met selectieve anti-enterovirus activiteit geselecteerd na een doorgedreven screening van een chemische bibliotheek. Een eerste klasse van inhibitoren die werd geïdentificeerd waren de thiazolobenzimidazoles. Een “lead” optimalisatie resulteerde in moleculen met krachtige antivirale activiteit en selectiviteit en liet ook toe de structuur-activiteitsrelatie te begrijpen. “Time of drug addition” studies gaven aan dat deze klasse van moleculen inwerken op een stap in de virale replicatiecyclus die zich situeert tussen de vroege (aanhechting, penetratie, ontmanteling) en late (vrijzetting) processen. Vervolgens werd aangetoond dat specifiek de synthese van viraal RNA, maar niet de synthese en/of “processing” van het virale polyproteïne geïnhibeerd wordt door deze klasse van moleculen. Selectie van coxsackievirus B3, resistent aan deze moleculen liet toe drie aminozuren (A224, I227 en A229) te identificeren, direct stroomafwaarts gelegen van ATPase/helicase motief C in het niet-strcuturele eiwit 2C. Door middel van “reverse genetics” werd de bijdrage van de geïdentificeerde mutaties aan het resistente fenotype bevestigd. Daarenboven bleken de recombinante virussen kruisresistent aan eerder geïdentificeerde enterovirus 2C inhibitoren, terwijl ze even gevoelig bleven aan moleculen die een ander viraal doelwit hebben. We konden als eerste aantonen dat het 2C proteïne van coxsackievirus B3 ATPase activiteit bezit. Deze enzymatische activiteit bleek evenwel niet geïnhibeerd in de aanwezigheid van een 2C inhibitor. We ontdekten dat enkel enterovirussen van groep B en D en niet van groep A en C gevoelig zijn aan inhibitie door de thizaolobenzimidazoles. Deze gevoeligheid bleek te correleren met de aanwezigheid van een conserveerde “AGSINA” sequentie ter hoogte van de positie waar de resistentiemutaties werden gevonden. Deze geconserveerde “AGSINA” sequentie blijkt dus ook een fylogenetische merker te zijn voor enterovirussen van groep B en D. Aangezien de kristalstructuur van enterovirus proteïne 2C nog niet bepaald is, werd er een structureel model gebouwd op basis van “homology modeling” met het “Large T Antigen” van SV40. Localizatie binnen dit model van de aminozuren die verantwoordelijk zijn voor het thiazolobenzimidazole-resistente fenotype geeft aan dat deze residuen gelegen zijn op de interfase waar twee 2C hexameren mogelijks dimerizeren tot de vorming van een functioneel dodecameer (zoals waargenomen voor het SV40 “Large T Antigen”). Daarom stellen we de hypothese voorop dat de antivirale thiazolobenzimidazoles enterovirus replicatie inhiberen door de vorming een functionele dodecameer-eenheid van proteïne 2C te verstoren.Een ander molecule waarvan we ontdekten werd dat het selectief de replicatie van enterovirussen remt is TTP-8307. Dit molecule inhibeert de synthese van viraal RNA volgens een dosisafhankelijk patroon en heeft, naar analogie met de thiazolobenzimidazoles, geen effect op de synthese en/of “processing” van het virale polyproteïne. Een eigenschap die gedeeld werd door alle TTP-8307-resistente varianten was de aanwezigheid van ten minste één mutatie in het niet-structurele eiwit 3A. Vier mutaties die in dit proteïne geïdentificeerd werden, werden gereïntroduceerd in een infectieuze “full-length” kloon van CVB3, wat tot een succesvolle reconstructie van het resistente fenotype leidde. Daarenboven werd er kruisresistentie geobserveerd met enviroxime, het enige molecule waarvan tot op heden gerappoteerd werd dat het enterovirus replicatie remt met 3A als doelwit. De gestelde hypothese luidt dat TTP-8307 bepaalde interacties van 3A met andere cellulaire/virale eiwitten verstoort.Met een voorheen gerapporteerde enterovirus inhibitor (MDL-860, een molecule dat uiteindelijk niet verder ontwikkeld werd) als basisstructuur werd er een reeks moleculen gesynthetiseerd met als doel het ontwikkelen van nog krachtigere analogen in een proces van “lead” optimalisatie-aangestuurd door inzichten in de structuur-activiteitsrelatie (SAR). Analogen met toegenomen antivirale activiteit werden verkregen. Daarenboven werd er eveneens een klasse van gesubstitueerde purine-analogen geïdentificeerd als inhibitoren van enterovirus replicatie. Ook voor deze klasse van moleculen werd een intensieve samenwerking opgezet met de betrokken medicinale scheikundige in een poging om de activiteit van deze klasse van moleculen op te drijven en om tegelijk inzichten te verwerven in hun structuur-activiteitsrelatie.Om de wereldwijde eradicatie van polio succesvol af te ronden, heeft de wereldgezonheidsorganisatie (WHO) verklaard dat het noodzakelijk is te beschikken over antivirale middelen die selectief de replicatie van poliovirussen remmen. Aangezien de kennis over remmers van poliovirus replicatie nog zeer beperkt is, werd er een vergelijkende studie opgezet naar de in vitro anti-poliovirus activiteit van een geselecteerde reeks picornavirus referentiemoleculen. Dit bracht verschillende inhibitoren aan het licht die zeer krachtig de replicatie van poliovirus remmen. Een aantal van deze moleculen (bv. rupintrivir) werden reeds in klinische studies geëvalueerd voor de behandeling van rhinovirus infecties. De bekomen resultaten vormen een perfecte uitgangsbasis voor de verdere succesvolle ontwikkeling van een efficiënte poliovirus inhibitor.In een tweede deel van dit proefschrift werd er een gedetailleerde karakterisatie van een muismodel voor enterovirus-geïnduceerde pancreatitis uitgevoerd. Het doel was om een eenvoudig en gebruiksvriendelijk model ter beschikking te hebben om de in vivo werkzaamheid te evalueren van oude en nieuw ontdekte enterovirus inhibitoren. Tevens moet de studie van selectieve antivirale of immunomodulatorische moleculen in dit model toelaten de impact van directe virale destructie of immuunpathologische componenten op de pathogenese van viraal-geïnduceerde pancreatitis afzonderlijk te definiëren. Een belangrijke observatie was dat de niveaus aan MMP-9 in de pancreas significant toegenomen waren na infectie met CVB4 en dat deze toegenomen enzymatische activiteit correleert met de graad van weefselschade in de exocriene pancreas (samenwerking met het Laboratorium voor Immunobiologie, Rega Instituut). Daarenboven werd er door middel van chlorite-oxidized oxyamylose (COAM), een immunomodulatorisch molecule, aangetoond dat directe virale replicatie slechts een geringe rol vervult in de destructie van het acinair pancreasweefsel. De weefselschade blijkt veeleer het gevolg te zijn van secundaire, immunologische componenten, i.e. mogelijks de infiltratie van neutrofielen.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Virology and Chemotherapy (Rega Institute)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.