ITEM METADATA RECORD
Title: Modulation of CFTR and ENaC channel function by interacting proteins and trafficking
Other Titles: Modulatie van de werking van CFTR en ENaC door interagerende proteïnen en cellulair transport.
Authors: Cao, Lishuang
Issue Date: 21-Oct-2005
Abstract: De Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) is een lid van de ABC transporter familie met een unieke dubbele functie. Enerzijds vormt het een cAMP-geactiveerd Cl- kanaal en anderzijds fungeert het als regulator van andere ionenkanalen en transporters, waaronder het amiloride–gevoelige epitheliaal natrium kanaal (ENaC). DF508 is de meest voorkomende mutatie in het CFTR-gen die to Mucovicidose (Cystische Fibrose; CF) leidt. Door een defect in transport en de processing van deze mutante vorm van CFTR bereikt het kanaal de plasmamembraan niet of nauwelijks. In dit werk bestudeerden we de modulatie van de CFTR- en ENaC-kanaalfunctie op niveau van interagerende proteïnen en cellulair transport.In het eerste deel van dit werk bestudeerden we de modulatie van de CFTR Cl- kanaalactiviteit bij een verhoogde MDR1-expressie. Eerst toonden we aan dat de CFTR-expressie en -functie daalt bij inductie van MDR1-expressie (door middel van een behandeling met doxorubicen). Heterologe expressie van MDR1 in Caco-2 cellen verlaagde de stromen door CFTR kanalen, terwijl co-expressie van MDR1 en CFTR geen effect op de CFTR functie had. Deze resultaten suggereren dat de reductie van de CFTR kanaalactiviteit volgt uit een verlaagde CFTR kanaaldensiteit in de plasmamembraan na inductie van MDR1 expressie, en dat er geen eiwit-eiwit interactie is tussen CFTR en MDR1.In het tweede deel werd getracht de wisselwerking tussen PP2A en de CFTR kanaalactiviteit te bepalen. Volgende resultaten werden bekomen:· PR65, een structurele subeenheid van PP2A, bleek in een yeast-two-hybrid test rechtstreeks te binden aan het R-domein van CFTR. Deze interactie werd verder bevestigd via pull-down en co-immunoprecipitatie.· Verdere experimenten toonden aan dat de eerste 10 HEAT repeats van PR65 rechtstreeks interageren met het R-domein van CFTR.· In vitro defosforylatie assays toonden aan dat PP2A in staat was het R-domein van CFTR te defosforyleren. Okadaic acid (OA), een specifieke inhibitor van PP2A, verhinderde PP2A-gemedieerde defosforylatie van het R-domein. Toevoeging van 10 mM OA aan de intracellulaire oplossing verlaagde significant de deactivatiesnelheid van de CFTR Cl- stroom, waarschijnlijk als gevolg van de inhibitie van PP2A en/of PP1. Een zelfde effect werd bekomen na overexpressie van PR1-10, een getrunceerde vorm van PR65.Deze resultaten duiden op een directe en functionele interactie tussen het R-domein van CFTR en PP2A. Mogelijk brengt deze interactie de catalytische subeenheid van PP2A dicht bij het R-domein van CFTR, hetgeen de defosforylatie en deactivatie van het kanaal vergemakkelijkt.In het derde deel van dit werk werden een aantal benaderingen getest met het doel de CFTR kanaalfunctie van de DF508-mutant te herstellen. In de eerste helft van het CFTR-eiwit bevinden zich een aantal RXR- motieven, die mogelijk een rol spelen bij de eiwitsortering in het endoplasmatisch reticulum (ER). We onderzochten of expressie van CFTR-fragmenten met een of meerdere RXR-motieven er toe zou leiden dat de DF508-mutant in de plasmamembraan geraakt met herstel van Cl- kanaalactiviteit. Volgende resultaten werden bekomen:· Co-expressie van DF508-CFTR met N-terminale fragmenten van WT CFTR WF1 en WF2 peptiden (respectievelijk 177 en 636 N-terminale aminozuren van WT CFTR) in COS-1 cellen veroorzaakte een significante stijging van de cAMP- geactiveerde Cl- stroom.· Co-expressie van DF508-CFTR met gemuteerde vormen van WF2 (R516K, R555K of RR516/555KK) resulteerde in een halvering van de cAMP- geactiveerde Cl- stroom in vergelijking met cellen die zowel DF508-CFTR als niet-gemuteerd WF2 tot expressie brachten. Co-expressie van DF508-CFTR met het RR1-fragment (M469 tot N597), dat twee RXR-motieven bevat, resulteerde ook in een significante stijging van de cAMP-geactiveerde Cl- stroom. Deze stijging werd niet waargenomen wanneer de RXR-motieven werden gemuteerd.· Co-expressie van DF508-CFTR met MDR1 of met fragmenten van MDR1 met RXR-motieven had geen effect op de cAMP-geactiveerde Cl- stroom.Uit deze experimenten concluderen we dat de DF508-CFTR-kanaalfunctie kan worden hersteld door co-expressie met getrunceerde CFTR-fragmenten die RXR-motieven bevatten. De expressie van korte polypeptiden is mogelijk een veelbelovende nieuwe strategie voor de functionele rescue van DF508-CFTR.In het laatste gedeelte van dit werk bestudeerden we de functionele expressie en intracellulaire distributie van het ENaC-kanaal. De mogelijke invloed van intracellulair Ca2+ op de rijping en het transport van ENaC werd onderzocht en volgende resultaten werden bekomen:· In menselijke JME/CF15 neusepitheelcellen, die endogeen DF508-CFTR exprimeren, werden amiloride-gevoelige Na+-stromen gemeten. Karakterisatie van deze stromen gaf aan dat deze stromen de typische eigenschappen van ENaC vertonen.· De ENaC-kanaalactiviteit kon enkel worden waargenomen in afwezigheid van EGF in het cultuurmedium. In overeenstemming met deze waarnemingen werd biochemisch aangetoond dat de geglycosyleerd aENaC verdween wanneer de cellen gekweekt werden in aanwezigheid van EGF. Immunocytochemische experimenten op gepermeabiliseerde JME/CF15 cellen toonden aan dat het ENaC proteïne in cellen opgegroeid in EGF-rijk medium voornamelijk in het intracellulaire gebied dicht bij de nucleus gelokaliseerd was, vermoedelijk in het ER. Dit in tegenstelling tot de intracellulaire distributie in cellen opgegroeid in EGF-arm medium, waar een meer disperse verdeling werd waargenomen.· Microfluorimetrische Ca2+ metingen toonden een verhoogde intracellulaire Ca2+ concentratie aan in JME/CF15 cellen na EGF behandeling. Behandeling van JME/CF15 cellen met 2 mM thapsigargin bootste het effect van EGF na, zowel op gebied van functionele expressie als op het gebied van de intracellulaire ENaC-distributie.Deze resultaten suggereren dat een chronische blootstelling aan EGF het transport en de membraanexpressie van ENaC negatief beïnvloedt en dat intracellulaire Ca2+ concentraties een belangrijke rol spelen in de maturatie en het transport van dit kanaal.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Forensic Biomedical Sciences
Department of Cellular and Molecular Medicine - miscellaneous
Physiology Section (-)
Human Mutations and Polymorphisms Section (-)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.