ITEM METADATA RECORD
Title: Structural studies on PAI-1: a contribution to rational drug design
Other Titles: Structurele studies van PAI-1: een bijdrage tot rationele geneesmiddelenontwikkeling
Authors: Dewilde, Maarten; M9800207
Issue Date: 25-Sep-2008
Abstract: Verschillende studies hebben de pathofysiologische rol van plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1) in verschillende pathologieën en in het bijzonder cardiovasculaire aandoeningen onderzocht. Deze cardiovasculaire aandoeningen zijn vaak het resultaat van een onevenwicht tussen de plasminogeen activatoren (PA; voornamelijk tPA) en plasminogeen activator inhibitoren (PAI; voornamelijk PAI-1). Aangezien PAI-1 de voornaamste fysiologische inhibitor van tPA in plasma is, zijn verlaagde PAI-1 waarden geassocieerd met een verminderde mortaliteit terwijl verhoogde plasma waarden worden geassocieerd met een ongunstige prognose. Het herstel van dit evenwicht is mogelijk via twee verschillende manieren, i.e. ofwel door het verhogen van de tPA waarden ofwel door het verlagen van de actieve PAI-1 concentratie door middel van inhibitoren. In de afgelopen jaren werden verschillende PAI-1 inhibitoren ontwikkeld, zoals verschillende organische molecules met een laag moleculair gewicht en monoklonale antilichamen. Deze inhibitoren kunnen PAI-1 op verschillende manieren inhiberen. Ten eerste zijn er inhibitoren die interfereren met de initiële interactie tussen PAI-1 en het proteïnase (tPA en uPA). Vervolgens zijn er molecules die de omzetting van actief PAI-1 naar latent PAI-1 versnellen. Ten derde zijn er molecules beschikbaar die een substraat gedrag bij PAI-1 induceren. Op vlak van de specificiteit en de sterkte waarmee ze PAI-1 kunnen inhiberen zijn de monoklonale antilichamen superieur in vergelijking met de organische molecules. Helaas is het therapeutisch gebruik van antilichamen afkomstig van muizen niet evident. Deze antilichamen zijn oraal niet actief en kunnen bovendien een immunogene respons veroorzaken wanneer ze toegediend worden aan mensen . Organische molecules met dezelfde specificiteit en sterkte als antilichamen zouden deze problemen niet hebben. Via rationele geneesmiddelenontwikkeling kunnen dergelijke molecules afgeleid worden. Deze benadering vereist echter structurele informatie over de wijze waarop deze antilichamen interageren met PAI-1. Hoofdstuk twee beschrijft de opheldering van de structuur van drie verschillende complexen (scFv-8H9D4/PAI-1 actief, scFv-8H9D4/PAI-1 latent and scFv-56A7C10/ PAI-1 actief) via computermodeling. De structuur van de verschillende scFv’s werd bekomen door middel van homologie modeling, m.b.v. de WAM server. De complexen werden gegenereerd met de ClusPro server en voor elk complex kon een finaal model geselecteerd worden. De interacties in de geselecteerde complexen zijn grotendeels in overeenstemming met de beschikbare epitoop en paratoop informatie. In het derde hoofdstuk werden vijf verschillende Fabs (Fab-8H9D4, Fab-33B8, Fab-33H1F7, Fab-55F4C12 en Fab-56A7C10) en hun complex met PAI-1 geselecteerd voor structurele karakterisering door middel van X-stralen proteïne kristallografie. De structuur van Fab-8H9D4, Fab-55F4C12 en Fab-56A7C10 werd op deze manier opgehelderd. De algemene structuur wordt in dit hoofdstuk besproken, en Fab-8H9D4 en Fab-56A7C10 worden bovendien vergeleken met hun respectievelijke modellen bekomen in hoofdstuk twee. Helaas kon er geen structuur bepaald worden voor de verschillende Fab/PAI-1 complexen aangezien geen kristallen bekomen werden. Hoofdstuk vier beschrijft de opheldering van het Fab-55F4C12/PAI-1 latent complex via computer modeling. Hiervoor werd de structuur van Fab-55F4C12 gebruikt die bekomen werd in hoofdstuk drie. In vergelijking met de modeling studie uit hoofdstuk twee werd hier een ander docking algoritme gebruikt (data gestuurde docking – HADDOCK) en de startstructuren waren meer accuraat (beide kristalstructuren). Het docking proces werd gestuurd door de beschikbare epitoop informatie. Daarna werden mogelijke paratoop residuen geïdentificeerd aan de hand van de bekomen modellen. Op basis van deze residuen werden de respectievelijke alanine mutanten aangemaakt in scFv-55F4C12, waarna de oorspronkelijk bekomen modellen werden getoetst aan de affiniteitsdata van deze mutanten. Op basis van deze gegevens kon echter geen enkel model weerhouden worden. Daarom werd een nieuw dockingexperiment opgestart, dit maal met zowel epitoop informatie (zoals ook gebruikt in het eerste experiment) als de nieuw bekomen paratoop informatie voor het sturen van het HADDOCK docking programma. Uit dit experiment kon een finaal model geselecteerd worden dat grotendeels in overeenstemming is met alle beschikbare biochemische informatie. Er zijn echter nog bijkomende mutagenese experimenten nodig om dit model finaal te valideren. Tenslotte werden in hoofdstuk 5 en 6 de structuur van respectievelijk gekliefd PAI-1-stab en latent muis PAI-1 opgehelderd met behulp van X-stralen proteïne kristallografie. De structuur van gekliefd PAI-1-stab is van hogere kwaliteit in vergelijking met de reeds eerder opgehelderde structuur van gekliefd PAI-1-A335P. De twee structuren werden gedetailleerd met elkaar vergeleken, even als met de structuur van actief PAI-1-stab. De bekomen data tonen aan hoe de verschillende stabiliserende mutaties hun effect uitoefenen en geven bovendien belangrijke inzichten over het werkingsmechanisme van PAI-1. Ook de opgehelderde structuur van muis PAI-1 draagt bij tot een beter inzicht in de structuur-functie relatie in PAI-1. Bovendien vertoont deze structuur kleine, maar belangrijke structurele verschillen in vergelijking met humaan PAI-1. Deze verschillen zijn belangrijk aangezien muizen vaak gebruikt worden als proefdieren, zowel bij onderzoek naar PAI-1 gerelateerde pathologieën als bij onderzoek naar PAI-1 inhiberende organische molecules. Deze structurele verschillen dienen dus in rekening gebracht te worden bij de interpretatie van de resultaten en bij een eventuele extrapolatie naar toepassingen bij de mens.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory for Pharmaceutical Biology (-)
Faculty of Pharmaceutical Sciences - miscellaneous
Biocrystallography

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.