ITEM METADATA RECORD
Title: Thymidine phosphorylase (TP) and TP inhibitors in angiogenesis and fluoropyrimidine metabolism.
Other Titles: Thymidine phosphorylase (TP) en TP inhibitoren in angiogenese en fluoropyrimidine metabolisme.
Authors: Bronckaers, Annelies
Issue Date: 17-Sep-2009
Abstract: Thymidine fosforylase (TP) werd ontdekt in de jaren ’50 als een enzym da t een sleutelrol speelt in het metabolisme van 2’-deoxypyrimidine nucleo siden. TP katalyseert de fosforolyse van thymidine en 2’-deoxyuridine to t hun respectievelijke base en 2-deoxy-D-ribose-1-fosfaat dat op zijn be urt snel omgezet wordt naar 2-deoxy-D-ribose (2DDR). Naast natuurlijke 2 ’-deoxypyrimidine nucleosiden, herkent TP ook een aantal anti-tumorale m oleculen zoals 5-fluoro-2’-deoxyuridine (FdUrd), 5- trifluorothymidine ( TFT) en 5-fluoro-5’-deoxyuridine (5’DFUR), een intermediair metaboliet v an capecitabine, dat frequent gebruikt wordt voor de behandeling van bor st- en dikke darm kanker. Meer dan 10 jaar geleden werd vastgesteld dat TP ook angiogene eigenschappen heeft. Zowel TP als 2DDR induceren migrat ie en tubevorming van endotheelcellen in vitro en bloedvatvorming in viv o. Daarnaast beschermt TP ook tumorcellen tegen apoptose. In een groot a antal studies werd aangetoond dat TP geassocieerd is met pathologische a andoeningen zoals kanker, reumatoïde arthritis en atherosclerose. Talrij ke tumoren, zoals long-, borst- en coloncarcinomen vertonen een verhoogd e expressie van TP. In een aantal van deze tumoren werd een positieve co rrelatie vastgesteld tussen TP expressie enerzijds en tumorgraad, metast ase en een kleinere kans op overleving anderzijds. Het precieze werkings mechanisme van TP is nog niet volledig ontrafeld, maar de enzymactivitei t van TP zou noodzakelijk zijn voor zijn angiogene werking. TP vormt dus een aantrekkelijk doelwit voor antikankertherapie. Daarom werd in deze studie het werkingsmechanisme van TP en de TP-inhibitor KIN59 verder ond erzocht. Een aantal jaren geleden werd in ons laboratorium de TP-inhibitor 5’-O-t ritylinosine (KIN59) geïdentificeerd. In tegenstelling tot eerder beschr even TP-inhibitoren, treedt KIN59 niet in competitie met de thymidine- o f fosfaatbindingsplaats van het enzym, maar inhibeert het TP op een niet -competitieve, allosterische manier. Om de moleculaire interactie van KI N59 met TP op te helderen, voerden we in samenwerking met Dr. M.-J. Pére z-Pérez (Madrid, Spanje) en Dr. F. Gago (Alcala, Spanje) een in silico a nalyse uit van de driedimensionale structuur van TP in complex met KIN59 . Deze computeranalyse identificeerde een ‘pocket’ waarin KIN59 zou pass en in de buurt van de Gly405-Val419 lus. Deze ‘pocket’ wordt gekenmerkt door een netwerk van waterstofbruggen waarin asparaginezuur 203 (Asp203) een cruciale rol speelt in de stabiliteit van deze lus, wat essentieel is voor efficiënte enzymkatalyse. M.b.v. plaatsgerichte mutagenese werd dit asparagine residue gemuteerd naar het neutrale alanine. Het mutante TP had een 60x lagere enzymatische activiteit dan het wild-type TP. Bove ndien vertoonde de niet-competitieve allosterische inhibitor KIN59 geen inhibitorische activiteit meer t.o.v. het gemuteerde enzym terwijl de TP -inhibitoren 6-aminothymine en 6-amino-5-bromouracil, die interageren me t de thymidinebindingsplaats van het enzym, wel in staat waren om zowel het wild-type TP als de mutant te remmen. Dus, wij konden het bestaan va n een tot nu ongekende, allosterische site in TP aantonen. Deze nieuwe a llosterische site zou mogelijk een rol kunnen spelen in de biologische a ctiviteit van TP. Naast het feit dat KIN59 een allosterische inhibitor is van TP, is het o ok in andere opzichten een uniek molecule. Voorheen kon onze onderzoeksg roep reeds aantonen dat in de ‘kip chorio-allantois membraan (CAM)’ test , KIN59 veel actiever is dan andere TP-inhibitoren. Naast TP-geïnduceerd e angiogenese, remde KIN59 ook de endogene bloedvatvorming in de CAM. De ze bevindingen suggereren dat KIN59 ook interageert met andere angiogene factoren. Verder verhinderde KIN59 niet alleen de vorming van nieuwe bl oedvaten, maar vernietigde het tevens reeds bestaande, premature bloedca pillairen van de CAM, wat leidde tot de hypothese dat KIN59 ‘vascular-di srupting’ activiteiten bezit. Deze intrigerende observaties zetten ons a an om de anti-angiogene en de ‘vascular-disrupting’ eigenschappen van KI N59 verder te onderzoeken. KIN59 remde ‘fibroblast growth factor-2’ (FGF -2)-gestimuleerde angiogenese, terwijl het ‘vascular-endothelial growth factor’ (VEGF)- geïnduceerde bloedvatvorming niet kon verhinderen. Daarn aast stelden we vast dat KIN59 dramatisch de proteïne expressie van lami nine (een proteoglycaan van de extracellulaire matrix) verminderde, terw ijl het molecule geen effect bleek te hebben op de proteïne expressie va n fibronectine, collageen I en collageen IV. Real-time RT-PCR analyse to onde aan dat KIN59 ook de mRNA expressie van laminine verlaagt, waaruit geconcludeerd kan worden dat dit nucleoside-analoog de transcriptie of d e mRNA stabiliteit van het lamininegen inhibeert. Deze gegevens bevestig en dus dat KIN59 de werking van verscheidene angiogene factoren verhinde rt. De meeste moleculen die een ‘vascular-disrupting’ activiteit bezitten, b lokkeren de celcyclus in de G2/M fase door het verstoren van de microtub uli organisatie. Om een verfijnder inzicht te krijgen in de vascular-dis rupting’ activiteiten van KIN59, werd de invloed van KIN59 op de celcycl usdistributie van muis endotheelcellen (MAEC) nagegaan. KIN59 induceerde een dosis-afhankelijke toename van cellen in de G2/M fase. Daarnaast to onden een in vitro tubuline polymerisatie test, immunocytochemie en West ern Blot analyse aan dat dit nucleoside analoog een zwakke inhibitor is van microtubuli polymerisatie. Op basis van deze resultaten kunnen we be sluiten dat KIN59 zowel anti-angiogene als ‘vascular-disrupting’ eigensc happen zou kunnen hebben. KIN59 zou dus een veelbelovend ‘lead’-molecule kunnen zijn voor de ontwikkeling van nieuwe, krachtige antikanker produ cten die gericht zijn tegen verscheidene doelwitten. In het volgende luik van deze verhandeling werd het werkingsmechanisme v an TP verder ontrafeld. Verscheidene studies toonden reeds aan dat TP de secretie stimuleert van een aantal angiogene factoren, zoals VEGF, inte rleukine-8 en enkele matrix metalloproteinases. Om andere angiogene medi atoren te identificeren die gemoduleerd worden door TP, werden neuroglio macellen (U87) getransfecteerd met TP en werd de secretie van 43 verschi llende angiogene factoren bestudeerd. Overexpressie van TP in U87 result eerde in een significant verhoogde secretie van angiopoïetine-1 (Ang-1), terwijl de proteïne expressie en secretie van Ang-2 drastisch verlaagd werd. Ook een verhoogde mRNA expressie van Ang-1 werd waargenomen in de TP-getransfecteerde cellen. Daarentegen toonde real-time RT-PCR analyse aan dat een verhoogde expressie van TP geen verschil veroorzaakt in de h oeveelheid Ang-2 mRNA. Hieruit blijkt dat TP vermoedelijk de Ang-2 expre ssie verlaagt door destabilisatie van het proteïne. Dit dient verder ond erzocht te worden. Toevoeging van thymidine of een inhibitor van TP (TPI ) had geen effect op de TP-geïnduceerde verandering in de Ang-1/Ang-2 se cretie, wat ons doet vermoeden dat niet de enzymatische activiteit van T P maar het proteïne zelf verantwoordelijk is voor de modulatie van Ang-1 en Ang-2. Tenslotte hebben we de invloed van een infectie met Mycoplasma hyorhinis op de cytostatische activiteit van verscheidene pyrimidine nucleoside-a nalogen onderzocht. Mycoplasma’s zijn kleine bacteriën die het slijmvlie s van het ademhalings- en urogenitaalstelsel koloniseren. Ze kunnen erns tige pathologische ziekten veroorzaken, maar een groot deel van de mense lijke bevolking blijkt chronisch geïnfecteerd te zijn met deze pathogene n zonder clinische symptomen te vertonen. Recente studies toonden aan da t M. hyorhinis aanwezig is in tumorweefsel en mogelijk een rol speelt in de ontwikkeling van kanker. Aangezien eerder werd aangetoond dat verschillende mycoplasma soorten TP tot expressie brengen en TP in staat is om bepaalde antikanker molecule n zoals FdUrd, TFT en 5’DFUR te (in)activeren, bestudeerden wij of ook M . hyorhinis codeert voor een TP dat deze cytostatische agentia herkent. Hiertoe werden de humane borstcarcinoomcellen (MCF-7) geïnfecteerd met M . hyorhinis en werd de cytostatische activiteit van FdUrd, BrdUrd, TFT e n 5’DFUR geanalyseerd. De cytostatische activiteit van FdUrd, BrdUrd en TFT bleek dramatisch (20 tot 150 keer) lager in de geïnfecteerde MCF-7 c ellen t.o.v de controle cellen. Incubatie met de TP-inhibitor TPI of pla smocin (een specifiek antibioticum tegen mycoplasma), zorgde voor een vo lledig herstel van de cytostatische activiteit van deze nucleoside-analo gen. Daarentegen veroorzaakte de mycoplasma-infectie een significante ve rhoging van de cytostatische activiteit van 5’DFUR. Ook dit effect kon o pgeheven worden door toevoeging van TPI of plasmocin. Uit deze resultate n blijkt dat FdUrd- en TFT-gebaseerde chemotherapie meer effectief zou k unnen zijn indien deze gecombineerd wordt met een TP-inhibitor of met ee n antibioticum dat specifiek gericht is tegen mycoplasma.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Laboratory of Virology and Chemotherapy (Rega Institute)
Animal Physiology and Neurobiology Section - miscellaneous

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.