ITEM METADATA RECORD
Title: Use of capillary electrophoresis in combination with mass spectrometry, spectrophotometry or capacitively coupled contactless conductivity detection in the analysis of drug substances
Other Titles: Toepassing van capillaire elektroforese in combinatie met massaspectrometrie, spectrofotometrie of C4D detectie in de analyse van geneesmiddelen
Authors: Carvalho, Alexandre; S0158359
Issue Date: 23-Sep-2009
Abstract: In deze studie werden capillaire elektroforese (CE) m ethodes ontwikkeld voor de kwaliteitscontrole van ritonavir (RTV), “Hipp eastrum hybrid agglutinines” (HHA) en natriumfosfocysteamine (SCP). Drie verschillende detectietechnieken werden toegepast nl. “diode array” det ectie, “capacitively coupled contactless conductivity detection” ( C4D) en massaspectrometrie (MS). In eerste instantie werd een CE methode ontwikk eld voor de bepaling van onzuiverheden in SCP. Voor de behandeling van c ystinose kan men cysteamine (CTE) toedienen, met de dosis verdeeld over 4 giften per dag door het korte halfleven, en dit is een succesvolle the rapie. Echter, voor verschillende patiënten is CTE te onaangenaam qua ge ur en smaak, hetgeen leidt tot een slechte therapietrouw. Om hieraan te verhelpen kan men SCP gebruiken want dit is minder weerzinwekkend en hee ft ook een langer halfleven, zodat het aantal giften per dag kan worden teruggebracht tot 2. De ontwikkelde CE methode laat toe de twee belangri jkste afbraakproducten van SCP, namelijk cystamine (CTA) en CTE, te bepa len met respectievelijk een LOQ van 30 µg/ml (0,2 %) en 16&nbs p;µg/ml (0,1 %). Het achtergrondelektrolyt (BGE) bevat 15 mM ammoni umacetaat (pH 8,85) met 10 % methanol. Onder deze omstandigheden zi jn CTE en CTA positief geladen en migreren sneller dan de elektroösmotis che flow (EOF). SCP daarentegen, is negatief geladen en migreert in de t egenovergestelde richting van de EOF. Hierdoor kan men een grote hoeveel heid SCP injecteren, aangezien de zeer grote SCP piek goed gescheiden is van de kleine piekjes van de onzuiverheden. De scheiding neemt minder d an 4 minuten in beslag. De methode werd ontwikkeld voor UV detectie bij een golflengte van 195 nm. Ze laat toe om op een snelle manier, en met lagere LOQ’s, de onzuiverheden in SCP monsters te bepalen, en vormt een goed alternatief voor de TLC methode die momenteel in voege i s. Hoewel “diode array” detectie zeer goed ingeburgerd i s, werd in dit werk ook de koppeling van CE met massaspectrometrie inten sief bestudeerd. Anderzijds werd “capacitively coupled contactless condu ctivity detection” geïntroduceerd in het laboratorium. Deze vorm van det ectie laat toe om verbindingen waar te nemen die geen of weinig UV licht absorberen, zonder dat het nodig is deze verbindingen te derivatizeren. De CE-MS en CE-C4D opstellingen werden zelf gebouwd. Electrospray ionisatie (ESI) werd gebruikt voor de CE -MS interfase. Hierbij werden twee benaderingen geëvalueerd, met name ee n pneumatische sheath liquid interfase (PASLI) en een liquid-junction ES I interfase. Voor de PASLI benadering werd gewerkt met CE capillairen me t de standaard buitendiameter. De invloed van fysische parameters op het sproeiproces werd bestudeerd. Eén van deze parameters was de relatieve positionering van het binnenste capillair (sheath liquid) ten opzichte v an het buitenste capillair (vernevelingsgas). De opstelling is zodanig o pgevat dat men deze afstand kan veranderen zonder de sproeier te moeten demonteren, hetgeen een vernieuwend aspect is. Voor de liquid-junction E SI interfase werd zuivere ESI uitgevoerd met een commercieel verkrijgbaa r roestvrij stalen buisje met een interne diameter van 125 µm. Dit buisje (originele buitendiameter 510 µm) werd aan het uiteinde spit svormig gemaakt met behulp van elektropolishing. De sheath liquid werd n iet gevoed door middel van een pomp, doch wel via een hydrostatisc he druk, geleverd met een zelf ontworpen opstelling. De gehaltebepaling van SCP gebeurt nu met iodimetrie. Hoewel titrimetris che gehaltebepalingen goed ingeburgerd zijn, en een heel goede precisie halen, is deze specifieke titratie niet eenvoudig en vereist ze redelijk wat ervaring van de analist. Daarom werd nagegaan of het ook mogelijk i s de gehaltebepaling van SCP uit te voeren met CE. Wanneer men fosfocyst eamine oxideert tot CTA, zou men dit laatste kunnen gebruiken als primai re standaard, eerder dan het onstabiele SCP. Dit was op het eerste zicht voor de handliggend, doch er werden verschillen waargenomen tussen de r esultaten bekomen met CE en titratie. CTA blijkt niet het enige reactiep roduct te zijn van de oxidatie met jood. Deze observatie zou ook de moei lijkheden kunnen verklaren waarmee men geconfronteerd wordt gedurende de iodimetrie van SCP. C4D en CE-MS werden gebruikt om dit verder te onder zoeken. CTA kan zelf ook traag worden geoxideerd door jood. Verder wordt besproken of titrimetrie kan worden vervangen door CE voor de gehaltebe paling van SCP. HIV “entry” en fusie-inhibitoren vertegenwoordi gen een nieuwe klasse van geneesmiddelen die nuttig zijn in de profylaxe en chemotherapie van AIDS. De plant lectines met de naam “Hippeastrum h ybrid agglutinines” zijn mannose bindende proteïnes (meer bepaald & #945;-(1,3) en α-(1,6)-mannose oligomeren) die kunnen tussenko men in de HIV infectie doordat ze een sterke interactie vertonen met het viraal glycoproteïne gp120. HHA wordt tegenwoordig getest als vaginaal microbicide om HIV transmissie te voorkomen. Een CZE methode werd ontwik keld voor de analyse van HHA monsters. De finale methode maakt gebruik v an 50 mM natriumtetraboraat (pH 9,9) als BGE. Door de hoge pH van de sch eidingsbuffer wordt adsorptie van eiwitten aan de capillaire wand vermed en, zodat de methode goed herhaalbaar is. RSDs waren in de ordegrootte v an 0,2 % voor de migratietijd en de detectiegevoe ligheid was in de ordegrootte van 70 µg/ml. Met deze me thode kan men een groep van ongeveer 30 isovormen onderscheiden, met een herhaalbaar patroon. HHA is een tetrameer eiwit samengesteld door combi natie van 8, structureel licht verschillende isovormen. Een combinatorië le analyse werd uitgevoerd en de resultaten waren in goede overeenstemmi ng met het patroon waargenomen in CE. Deze meer wiskundige benadering la at op een eenvoudige wijze toe om dit soort van resultaten te interprete ren. Ritonavir is een synthetische peptidomimetische HIV p rotease inhibitor die sinds 1996 in gebruik is voor de behandeling van AIDS. Hier wordt een CE methode beschreven die toelaat RTV te schei den van drie synthetische precursoren, die in het afgewerkt product zoud en kunnen voorkomen. Door de lage wateroplosbaarheid van RTV en enkele v an deze onzuiverheden, werd een micellaire elektrokinetische chromatogra fie (MEKC) methode ontwikkeld. De scheiding wordt uitgevoerd met een ele ktrolyt bestaande uit 15 mM natriumtetraboraat (pH 9,6), 30 mM natriumdo decylsulfaat met 18 % acetonitril. Eén van de belangrijkste uitdagi ngen gedurende de methodeontwikkeling, was het vinden van een goed compr omis tussen de oplosbaarheid van het monster en de scheiding. Mits gebru ik van hoge concentraties acetonitril in het BGE konden meer geconcentre erde monsters geanalyseerd worden, maar in dat geval was er geen goede s cheiding. Bijgevolg werd de oplosbaarheid grondig onderzocht, en werden uiteindelijk twee verschillende oplosvloeistoffen voorgesteld teneinde v oor elke onzuiverheid de hoogste gevoeligheid te kunnen bereiken. Een go ede herhaalbaarheid werd bekomen voor de migratietijd (RSD ongeveer 0,4& nbsp;%) en piekoppervlakte (RSD ongeveer 0,8 %). De kwantificerings limiet (LOQ) laate toe om de twee onzuiverheden 5-thiazole wing en 2,4-t hiazole wing te bepalen tot 0,005 %, en de derde onzuiverheid Boc-c ore tot 0,3 %. In vergelijking met de gradiënt LC methode die voorh een werd ontwikkeld op het laboratorium, is deze CE methode sneller en e envoudiger, en kan men er ook de onzuiverheid Boc-core mee bepalen.
Table of Contents: ACKNOWLEDGMENTS i
CURRICULUM VITAE iii
LIST OF PUBLICATIONS iv
TABLE OF CONTENTS v
LIST OF ABBREVIATIONS AND SYMBOLS ix
SUMMARY 1
SAMENVATTING 5

Chapter 1 General introduction 11
1.1 Capillary electrophoresis 11
1.1.1 Short overview of capillary electrophoresis 11
1.1.2 Detection in capillary electrophoresis 21
1.1.3 Capacitively coupled contactless
conductivity detection 23
1.2 Combination of mass spectrometry and
capillary electrophoresis 28
1.2.1 Short overview of the mass spectrometry
instrumentation 28
1.2.2 General considerations about the
hyphenation CE-MS 32
1.2.3 Electrospray ionization 34
1.3 Cystinosis and its treatment 37
1.3.1 Cystinosis – the disease 37
1.3.2 Cystinosis treatment 39
1.4 Acquired immune deficiency syndrome (AIDS)
and its treatment 41
1.4.1 AIDS and human immunodeficiency virus 41
1.4.2 Highly active antiretroviral therapy (HAART)
against HIV 45
1.4.3 New drugs and microbicides against HIV 46
1.5 Aims of the study 48

Chapter 2 Capillary electrophoresis method
development for determination of impurities in
sodium cysteamine phosphate samples 49
Abstract 50
Keywords 50
1 Introduction 51
2 Material and Methods 53
2.2 Buffer preparation 54
2.3 Software 54
2.4 Capillary electrophoresis 54
3 Results and discussion 55
4 Conclusions 61
5 Acknowledgments 62
6 References 62

Chapter 3 A capillary electrophoresis - mass spectrometry
study for the quantification of sodium cysteamine
phosphate samples after iodine oxidation 65
Abstract 66
Keywords 66
1 Introduction 67
1.1 Cystinosis 67
1.2 Cystinosis treatment 67
1.3 Cysteamine and related compounds
physiological importance 69
1.4 Quality control of sodium cysteamine phosphate 70
2 Material and Methods 71
2.1 Chemicals and solutions preparation 71
2.2 CE-C4D-DAD 71
2.3 CE-ESI-MS 73
3 Results and discussion 75
3.1 CE-ESI-MS interface development 75
3.1.1 Pneumatic-assisted SLI 76
3.1.2 Liquid-junction ESI interface 85
3.2 CE determination of SCP, CTE and CTA 88
3.3 Mass spectrum of the studied substances 92
3.4 CE-ESI-MS study of the oxidation
products of cystamine 94
3.5 CE-C4D 98
3.6 CE-DAD determination of SCP 100
4 Conclusions 101
5 Acknowledgments 103
6 References 103

Chapter 4 Capillary zone electrophoresis method
development for the analysis of Hippeastrum
hybrid agglutinin samples 107
Abstract 108
Keywords 108
1 Introduction 109
2 Material and Methods 110
3 Results and discussion 112
3.1 Method development 112
3.2 HHA cluster interpretation 114
3.3 Method validation 118
4 Conclusions 121
5 Acknowledgments 121
6 References 121

Chapter 5 Micellar electrokinetic chromatography
method development for determination of
impurities in Ritonavir 123
Abstract 124
Keywords 124
1 Introduction 125
2 Material and Methods 127
3 Results and discussion 129
3.1 Method development – separation BGE 129
3.2 Method development – sample dilution 133
3.3 Determination of the relative response factor 135
3.4 Linearity, repeatability and sensitivity 137
4 Conclusions 138
5 Acknowledgments 138
6 References 139

Chapter 6 General Discussion 141

REFERENCES 151
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Pharmaceutical Analysis

Files in This Item:
File Status SizeFormat
Thesis AZC final.pdf Published 2162KbAdobe PDFView/Open Request a copy

These files are only available to some KU Leuven Association staff members

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.