ITEM METADATA RECORD
Title: Increased insight into the hydrolysis of starch by amylolytic enzymes
Other Titles: Verhoogd inzicht in de hydrolyse van zetmeel door amylolytische enzymen
Authors: Bijttebier, Annabel
Issue Date: 26-Aug-2009
Abstract: Zetmeel is het belangrijkste reservepolymeer dat voorkomt in gewassen zo als maïs, rijst, tarwe en aardappelen. Het is hoofdzakelijk opgebouwd ui t twee glucosepolymeren: (1) amylose, een grotendeels lineair polymeer e n (2) amylopectine, een sterk vertakt polymeer. Amylasen van verschillende oorsprong hydrolyseren de glycosidische verbi ndingen van zetmeel op een verschillende, niet-willekeurige manier. Hoew el de eerste hydrolytische aanval min of meer op een willekeurige plaats in zetmeelmolecules gebeurt, hangt de manier waarop de zetmeelstructuur wordt gewijzigd door enzymatische hydrolyse onder andere af van het act iepatroon van het gebruikte amylase. Dit doctoraat had als doel het inzi cht in de zetmeelhydrolyse door amylasen te verfijnen en de relatie tuss en het actiepatroon van amylasen en de zetmeeleigenschappen na (beperkte ) amylolyse te verduidelijken. De multiple attack-actie, die inhoudt dat een amylase verschillende glyc osidische bindingen splitst na de eerste random hydrolytische aanval en voor het dissocieert van zijn substraat, wordt frequent gebruikt om vers chillen in actiepatronen van amylasen te verklaren. In deze context word t de degree of multiple attack (DMA) gedefinieerd als het aantal binding en die gehydrolyseerd worden tijdens de levensduur van een enzym-substra at-complex min 1 (namelijk de eerste random hydrolytische aanval). In het eerste deel van het experimentele werk, werden de actiepatronen v an verschillende amylasen op aardappelamylose bestudeerd aan de hand van de relatie tussen de daling in de iodiumwaarde (een maat voor de daling van het moleculair gewicht van amylose) en de toename in de totale redu cerende waarde (een maat voor het aantal hydrolytische aanvallen) tijden s de hydrolyse. Voor de verschillende bestudeerde amylasen waren deze re laties verschillend, wat wijst op een niet-willekeurige hydrolyse van am ylose. DMA-waarden van de verschillende amylasen werden berekend als de verhouding tussen de toename in totale reducerende waarde (dRVTS) en de toename in gevormde reducerende polysachariden (dRVPS) min 1 tijdens de hydrolyse van aardappelamylose. Het maltogeen alfa-amylase v an Bacillus stearothermophilus (ook als Geobacillus s tearothermophilus gekend) (BStA) (12.1) had de hoogste DMA, gevo lgd door PPA (8.0). De alfa-amylases van B. licheniformis< />, (BLA) (4.7), B. amyloliquefaciens (BAA) (3.9), Th ermoactinomyces vulgaris (TVA, alfa-amylase I) (3.8) en van B. subtilis (BSuA) (3.1) hadden intermediaire DMA-waarden. Het al fa-amylase van Aspergillus oryzae (TAKA) (2.5) had de laagste DMA. Er werd aangetoond dat de totale reducerende waarde die overeenste mt met een daling van de relatieve iodium-waarde tot 80% (RV80-waa rde) een alternatief is voor de complexe DMA-bepaling. De RV80-waa rden op amylose van de bestudeerde amylasen waren in het algemeen gelijk aardig of hoger wanneer de temperatuur werd verhoogd, waarbij de mate va n toename afhankelijk was van het amylase. Voor het maltogene BStA werd, opmerkelijk, een verlaagde graad van multiple attack vastgesteld bij ee n toename van de temperatuur. Dit impliceert een meer uitgesproken endo- actie. In het algemeen is amylopectine het belangrijkste substraat bij de hydro lyse van zetmeel. Het blijft echter onduidelijk of een amylase amylopect ine eveneens via een multiple attack-actie hydrolyseert. Gebaseerd op de resultaten met amylose werden voor dit deel van het werk vijf amylasen geselecteerd met significant verschillende actiepatronen: BAA en TAKA, e ndo-alfa-amylasen met respectievelijk een intermediaire en een lage DMA, PPA, een endo-alfa-amylase met een hoge DMA, het maltogeen amylase BStA en als laatste, BCB als referentie voor een exo-hydrolyserend enzym. In een eerste reeks van experimenten, werden de actiepatronen van deze a mylasen met amylopectine als substraat onderzocht op een gelijkaardige m anier als voor amylose. De relatie tussen de relatieve iodium-waarde en de hoeveelheid reducerende suikers vrijgezet tijdens de amylolyse van am ylopectine, toonde aan dat amylopectine niet volledig willekeurig werd g ehydrolyseerd. Verder kon besloten worden dat de verhouding dRVPS/ dRVTS een waardevolle maat is voor de hydrolyse van de interne ket ens ten opzichte van de gehele hydrolyse van de amylopectine-structuur, en werd de nieuwe term level of inner chain attack (LICA), geïntroduceer d. BAA en TAKA hydrolyseerden de langere interne ketens van amylopectine in grotere mate dan PPA. Voor BStA en BCB was de hydrolyse van de inter ne ketens van amylopectine verwaarloosbaar tot zelfs onbestaand. De DMA-waarden op amylose, de LICA-waarden, de aard van de tijdens de hy drolyse teruggevonden oligosachariden en de residuele amylopectinestruct uur zijn hoogstwaarschijnlijk gerelateerd. De LICA-waarde bepaalt hoofdz akelijk de impact van het amylase op de grootte van amylopectine. Amylas en met een hoge LICA, zoals BAA en TAKA, reduceren de macromoleculaire g rootte van amylopectine drastisch reeds vanaf de beginfase van de hydrol yse. Amylasen met een lage of verwaarloosbare LICA, zoals PPA en BStA, r educeren de moleculaire grootte van amylopectine veel trager met toeneme nde graad van solubilisatie. Voor een zekere hoeveelheid oligosachariden gedetecteerd, wijzigden BAA en TAKA de gemiddelde ketenlengte (CL) en d e ketenlengteverdeling van amylopectine drastisch, terwijl voor PPA de a fbraak van de amylopectine-structuur (CL en ketenlengteverdeling) minder sterk uitgesproken was. Bijkomend werden voor PPA verschillende subpopu laties (met degree of polymerisation (DP) 2-3, DP 7-8 and DP 10-11) van amylopectineketens met gelijkaardige relatieve hoeveelheden gedetecteerd tijdens de latere fases van de hydrolyse. Voor BAA en TAKA, waren de re sultaten in overeenstemming met het vrijzetten van eerder grote oligosac hariden, gecombineerd met een lage graad van multiple attack op de amylo pectineketens. Voor PPA kunnen de resultaten verklaard worden door het v oornamelijk vrijzetten van maltose in combinatie met een hoge graad van multiple attack-actie op amylopectine. In overeenstemming met zijn exo-a ctie, hydrolyseerde BCB uitsluitend de externe ketens van amylopectine e n reduceerde daarbij nauwelijks de moleculaire grootte van amylopectine. BCB voerde verschillende opeenvolgende aanvallen (multiple attacks) uit op het substraat, waarbij maltose werd vrijgezet en trimde hierbij de e xterne amylopectine ketens successief af tot DP 2 of 3. Slechts wanneer grote hoeveelheden oligosachariden werden vrijgezet, was de CL van het r esiduele amylopectine gereduceerd en werden de wijzigingen in de amylope ctine-ketenlengteverdeling significant. Het maltogene BStA hydrolyseerde tijdens de beginfase van de hydrolyse bij voorkeur externe ketens van a mylopectine, ongeveer gelijkaardig aan een exo-amylase. Tijdens de later e fases van de hydrolyse hydrolyseerde het ook interne ketens en wijzigd e daarbij de amylopectinestructuur op een meer uitgesproken wijze. De mu ltiple attack-actie was, op een analoge manier als voor PPA, weerspiegel d in het voorkomen van verschillende subpopulaties bij DP 2, DP5-6 en DP 8 in de lage DP regio van de amylopectine-ketenlengteverdeling. Samengevat dragen deze resultaten bij tot een verhoogd inzicht in de ver schillen in actiepatronen van de amylasen, waartoe verschillen in onder andere vrijgezette oligosachariden, verschillen in LICA en verschillen i n graad van multiple attack behoren en die weerspiegeld worden in het am ylopectinestructuur na hydrolyse. Op dit ogenblik is echter geen methode beschikbaar voor de bepaling van de DMA op de amylopectineketens, niett emin zijn we ervan overtuigd dat deze waarde gecorreleerd is met de DMA- waarde op amylose. Om de relatie tussen zetmeeleigenschappen, amylase-eigenschappen en zetm eelhydrolyse meer in detail te bestuderen, werd de hydrolyse van drie ve rschillende zetmelen van maïs (dent, waxy and hoog-amylose), zowel verst ijfseld als natief, door vijf verschillende amylasen (BAA, TAKA, PPA, BS tA and BCB) bestudeerd. De gesolubiliseerde reducerende suikers (SSre d) en de totale hoeveelheid koolhydraten (als glucose) gesolubiliseer d (TSSgluc) werden bepaald tijdens hydrolyse. Wanneer de amylasen werden vergeleken, werden minstens tijdens de beginf ase van de hydrolyse geen significante verschillen gevonden in SSred< /> gesolubiliseerd in functie van de tijd voor de drie verschillende ver stijfselde substraten. Verschillen in de TSSgluc profielen werden voornamelijk bepaald door de verschillende oligosachariden die werden ge detecteerd bij de hydrolyse van verstijfseld zetmeel. Verstijfseld hoog-amylose-maïszetmeel werd op een verschillende manier g ehyrolyseerd dan verstijfseld dent- en waxy-maïszetmeel. Hoog-amylose-ze tmeel is een belangrijke bron van type III enzymweerstandig zetmeel wat kan verklaren waarom, tijdens de latere fases van de hydrolyse, SSred va n verstijfseld hoog-amylose-maïszetmeel significant lager was dan van ve rstijfseld dent- en waxy-maïszetmeel. In tegenstelling tot wat werd vastgesteld voor verstijfseld zetmeel en h oewel gelijkaardige enzymactiviteiten werden toegevoegd, verschilden de SSred profielen tijdens alle fases van de hydrolyse van natief zet meel wanneer verschillende amylasen werden vergeleken. Voor de drie vers chillende endo-alfa-amylasen (PPA, BAA and TAKA), werd een duidelijke co rrelatie vastgesteld tussen de relatieve graad van adsorptie aan het opp ervlak van granulair zetmeel en de (initiële) hoeveelheid gesolubiliseer de reducerende suikers. BCB solubiliseerde tijdens natieve zetmeelhydrol yse in het algemeen een lagere hoeveelheid reducerende suikers dan de en do-alfa-amylases. Initieel solubiliseerde het maltogeen alfa-amylase&nbs p;BStA tijdens de natieve zetmeelhydrolyse een zeer grote hoeveelheid re ducerende suikers. Zoals voor de endo-alfa-amylasen, kan dit wellicht ve rklaard worden door de bijna volledige adsorptie van BStA aan de zetmeel granules. De verschillen tussen de oligosachariden gedetecteerd tijdens hydrolyse van de natieve zetmelen door de verschillende amylasen waren m inder significant dan bij hydrolyse van de corresponderende verstijfseld e zetmelen. In het algemeen werden hoofdzakelijk kleine oligosachariden, zoals maltose en maltotriose, gedetecteerd. De verschillen in multiple attack- actie zullen voornamelijk weerspiegeld zijn in de residuele stru ctuur van de zetmeelpolymeren na hydrolyse. Het is echter mogelijk dat d eze verschillen weerspiegeld werden in de hoeveelheid suikers die in opl ossing werden gebracht. Zetmelen met een verschillende amylose/amylopectine-verhouding werden in verschillende mate gesolubiliseerd. Voor alle amylasen vertoonde natief hoog-amylose-maïszetmeel de hoogste resistentie tegen hydrolyse terwijl de verschillen in hydrolyseprofielen tussen natief dent-maïszetmeel en natief waxy-maïszetmeel eerder klein tot zelfs verwaarloosbaar waren en bovendien afhankelijk van het amylase. Tenslotte was de relatie tussen d e graad van adsorptie aan de zetmeelgranule en de graad van solubilisati e niet éénduiding wanneer de verschillende substraten werden vergel eken.
Table of Contents: Table of contents i
List of abbreviations v
Summary vii
Samenvatting xi
Introduction xv

Part One: LITERATURE REVIEW 1
Chapter I: STARCH – composition, structure and physico-chemical behaviour 3
Introduction 3
I.1 Starch composition 3
I.1.1 Amylose 4
I.1.2 Amylopectin 5
I.1.3 Minor components 8
I.2 Starch structure 9
I.2.1 Starch granule: growth rings, lamella and blocklets 9
I.2.2 Starch structure: crystallinity 14
I.3 Physico-chemical behavior of starch 15
I.3.1 Gelatinisation and pasting 16
I.3.2 Retrogradation 18
I.3.2.1 Amylose solution 18
I.3.2.2 Amylopectin solution 18
I.3.2.3 Starch 19
I.4 Relation between starch structure and physico-chemical behaviour 20
I.4.1 Influence of amylose content 21
I.4.2 Influence of amylopectin structure 22

Chapter II: AMYLASES – starch hydrolysing enzymes 25
Introduction 25
II.1 Glycoside hydrolases 25
II.1.1 Classifications 25
II.1.2 Catalytic structure 26
II.1.3 Catalytic mechanism 27
II.2 Family 13 glycosyl hydrolases 28
II.3 Family 14 and family 15 glycosyl hydrolases 31
II.4 Action pattern of amylases 33
II.4.1 Definitions 33
II.4.2 Experimental analysis of the action pattern 35
II.4.2.1 The first reports on multiple attack action 35
II.4.2.2 Amylose as a substrate 36
II.4.2.3 Malto-oligosaccharides as a substrate 37
II.4.2.4 Amylopectin as substrate 37
II.4.2.5 Multiple versus preferred attack 38
II.4.3 Influence of pH and temperature on the action pattern 39
II.4.4 Mechanism of multiple attack 40

Chapter III: AMYLOLYTIC HYDROLYSIS OF STARCH 45
Introduction 45
III.1 Industrial applications of amylases 45
III.2 Starch amylolysis 46
III.3 Starch amylolysis depends on the characteristics of the starch 49
III.3.1 Granular characteristics 49
III.3.2 Amylose/amylopectin content and structure 50
III.3.3 Crystallinity 52
III.4 Starch amylolyis depends on the characteristics of the amylase 52

Final considerations 54

Part Two: EXPERIMENTAL WORK 57
Chapter IV: AMYLASES – action pattern on amylose 59
Introduction 59
IV.1 Materials and methods 60
IV.1.1 Materials 60
IV.1.2 Amylase activity assay 60
IV.1.3 Action pattern with potato amylose 61
IV.1.3.1 Amylose solution 61
IV.1.3.2 Amylose hydrolysis 62
IV.1.3.3 Blue value of the hydrolysate 62
IV.1.3.4 Total level of reducing sugars of the hydrolysate (RVTS) 62
IV.1.3.5 Level of reducing polysaccharides of the hydrolysate (RVPS) 62
IV.1.3.6 Calculation of RV80, RV50 and DMA 63
IV.1.3.7 Statistical evaluation 63
IV.1.4 Action pattern with chromophoric substrates 64
IV.1.4.1 Azurine-crosslinked amylose 64
IV.1.4.2 Soluble red starch chromophoric substrate 64
IV.2 Results and discussion 66
IV.2.1 Action pattern on potato amylose in solution 66
IV.2.1.1 Action pattern and DMA at 35 °C 66
IV.2.1.2 RV80-value as an expression for the multiple attack action 68
IV.2.1.3 Effect of temperature on the action pattern 70
IV.2.1.4 Mechanism of multiple attack 73
IV.2.2 Action pattern with chromophoric substrates. 75
IV.3 Conclusion 80

Chapter V: AMYLASES – hydrolysis of amylopectin 81
Introduction 81
V.1 Materials and methods 82
V.1.1 Materials 82
V.1.2 Amylase activity assay 82
V.1.3 Action pattern with maize amylopectin 83
V.1.3.1 Amylopectin solution and hydrolysis 83
V.1.3.2 KI/I2-value of the hydrolysates 84
V.1.3.3 Total level of reducing sugars of the hydrolysate (RVTS) 84
V.1.3.4 Level of reducing polysaccharides of the hydrolysates (RVPS) 84
V.1.3.5 Calculation of RV80, RV50 and DMA 84
V.1.4 Structural analysis of amylopectin residues after limited amylolysis 84
V.1.4.1 (Limited) amylolysis of gelatinised waxy maize starch 85
V.1.4.2 Analysis of soluble oligosaccharides 86
V.1.4.3 HPAEC-PAD 86
V.1.4.4 Molecular size distribution of intact and residual amylopectin 86
V.1.4.5 Fine structure of intact and residual amylopectin 87
V.1.5 Statistical evaluation 87
V.2 Results and discussion 88
V.2.1 Action pattern on amylopectin in solution 88
V.2.1.1 Action pattern at 35 °C 88
V.2.1.2 Effect of temperature on the action pattern. 91
V.2.1.3 Value of the method used to study the action pattern of amylases on amylopectin. 92
V.2.2 Structural analysis of amylopectin residues after limited amylolysis 95
V.2.2.1 (Limited) amylolysis of gelatinised waxy maize starch 95
V.2.2.2 Molecular size and fine structure of (partially) hydrolysed amylopectin. 98
V.2.3 The action pattern of an amylase reflected in the residual amylopectin structure? 105
V.2.3.1 Non-maltogenic alpha-amylases 105
V.2.3.2 beta-Amylase 107
V.2.3.3 Maltogenic alpha-amylase 108
V.2.3.4 Amylopectin hydrolysis: multiple attack or level of inner chain attack? 109
V.3 Conclusion 111

Chapter VI: AMYLASES – hydrolysis of starch 113
Introduction 113
VI.1 Materials and methods 114
VI.1.1 Materials 114
VI.1.2 (Limited) Hydrolysis of gelatinised starch 114
VI.1.3 Adsorption of amylase 115
VI.1.4 (Limited) Hydrolysis of native starch 115
VI.2 Results and discussion 116
VI.2.1 (Limited) Hydrolysis of gelatinised starch 116
VI.2.2 Native starch hydrolysis 125
VI.2.2.1 Adsorption of amylases 125
VI.2.2.2 Hydrolysis of native starches by different amylases 127
VI.2.3 Conclusions 138
General conclusions and perspectives for further work 141
References 145
List of tables 163
List of figures 165
List of publications 173
ISBN: 978-90-8826-105-3
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Centre for Food and Microbial Technology
Intellectual Property

Files in This Item:
File Status SizeFormat
doctoraat annabel bijttebier.pdf Published 6173KbAdobe PDFView/Open

 


All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.