ITEM METADATA RECORD
Title: In vitro differentiation of pluripotent stem cells towards the hepatic lineage by mimicking embryonic and fetal liver
Other Titles: In vitro differentiatie van pluripotente stamcellen naar hepatocyte-achtige cellen door de embryonale en fetale leverontwikkeling na te bootsen
Authors: Pauwelyn, Karen; S0039112
Issue Date: 17-Jun-2009
Abstract: Definitie en eigenschappen van stamcellenDefinitie. Stamcellen worden gedefinieerd door drie belangrijke karakteristieken die hen onderscheiden van andere celtypes: het zijn vooreerst ongedifferentieerde cellen die zichzelf langdurig kunnen hernieuwen, ze kunnen anderszijds differentiëren naar één of meerdere mature celtypes, wanneer ze onder bepaalde fysiologische of experimentele condities worden gebracht, en tenslotte hebben ze de capaciteit om op een robuste manier een bepaald weefsel functioneel te repopuleren. Stamcellen worden onderverdeeld volgens hun potentie. Totipotentie verwijst naar het vermogen van een cel om een volledig nieuw individu te vormen, zoals de zygote. Pluripotente cellen kunnen omgevormd worden tot de meeste celtypes waaruit een embryo is samengesteld, maar ze zijn niet in staat om vanuit één cel een volledig individu te vormen. Multipotente en unipotente stamcellen, geïsoleerd uit adult weefsel, liggen aan de basis van respectievelijk verschillende of één mature celtypes.Embryonale stamcellen. Het prototype van pluripotente stamcellen zijn de embryonale stamcellen (ESC), bekomen uit de blastocyst van een muis, humaan of rat embryo. Er bestaat een complex netwerk van factoren die ervoor zorgen dat deze stamcellen blijven delen zonder hun pluripotente eigenschappen te verliezen. De transcriptiefactor Oct4 wordt beschouwd als de belangrijkste bewaker voor behoud van pluripotentie. Recent werden cellen met pluripotente eigenschappen, sterk gelijkend op embryonale stamcellen verkregen door introductie van een 2 verschillende cocktails van transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, C-Myc, Klf4 of Oct4, Lin28, Nanog en Sox2) in adulte somatische cellen. Zij worden aangeduid als geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).Multipotente adulte progenitor cellen. De groep van Dr. Verfaillie was in staat om ook vanuit post-nataal beenmerg van muizen en ratten, cellen te isoleren, die gekenmerkt zijn door een hoge expressie van Oct4. Deze cellen werden benoemd als Multipotente adulte progenitor cellen (MAPC). MAPC exprimeren echter geen Nanog of Sox2, andere transcriptiefactoren gerelateerd aan pluripotentie, die wel geëxprimeerd zijn in embryonale stamcellen. In tegenstelling tot embryonale stamcellen die direct geïsoleerd worden uit de binnenste celmassa van een blastocyst, verkrijgen MAPC pas hun pluripotente eigenschappen na langdurige celkweek. Ze zijn derhalve vermoedelijk het resultaat zijn van een kweek-geïnduceerde genetisch reprogrammeringsproces. MAPC vertonen niet alleen gelijkenissen met embryonale stamcellen (Oct4 expressie, nood aan Leukemia inhibitory factor voor behoud van proliferatie en pluripotentie zoals bij muis embryonale stamcellen), maar ook met primitief endodermale cellijnen (extra-embryonaal weefsel) omwille van een gelijkaardig genexpressie profiel en de mogelijkheid tot vorming van tumoren met karakteristieken van de dooierzak na subcutane injectie van rMAPC in immunodeficiënte muizen. MAPC hebben echter een bredere differentiatiecapacteit dan primitief endodermale cellijnen, gezien zij, zoals embryonale stamcellen, in staat zijn om in vitro te differentiëren tot mesodermale en endodermale, en in mindere mate tot neuroectodermale celtypes.Hepatische differentiatie van rat multipotente adulte progenitor cellenDoel van het onderzoek. Stamcellen zijn niet alleen attractieve kandidaten als bron voor celtransplantatie in de regeneratieve geneeskunde, maar ze vertegenwoordigen ook een uniek in vitro systeem om de embryologie van zoogdieren te onderzoeken. Het belangrijkste doel van deze thesis bestond uit het ontwikkelen van een rationeel systeem om pluripotente stamcellen om te vormen tot cellen met eigenschappen van hepatocyten, door de embryologische leverontwikkeling zo goed mogelijk na te bootsen.Achtergrond en rationale van het onderzoek. Tijdens de embryologische ontwikkeling van de lever worden verschillende stadia doorlopen, waarbij telkens andere factoren of cytokines belangrijk zijn. Vanuit de epiblast van de blastocyst ontwikkelen zich tijdens gastrulatie het definitief endoderm en mesoderm, alsook voorlopers van het ectoderm. Mesendodermale progenitor cellen migreren via de primitieve streak. Blootstelling van deze progenitor cellen aan een hoge concentratie Activin-A of Nodal resulteert in een preferentiële differentiatie tot definitief endoderm, terwijl lagere concentraties volstaan voor inductie van definitief mesoderm. Vervolgens differentieert het definitief endoderm verder tot hindgut, foregut en midgut endoderm. De lever ontstaat uit het foregut endoderm, mede onder invloed van factoren gesecreteerd uit het naburige cardiale mesoderm (fibroblast growth factor 2 of FGF2) en septum transversum mesenchym (bone morphogenic protein 4 of BMP4). Uit het foregut endoderm ontstaat de liver bud, die bipotentiële hepatoblasten huisvest, die zowel hepatocyten als cholangiocyten kunnen vormen. De Notch2/Jagged1 en Activin/TGFbeta-pathway zijn van belang voor het regelen van de differentiatie van bipotentiële hepatoblasten naar ofwel hepatocyten of cholangiocyten. Bij de verdere hepatische maturatie spelen factoren zoals FGFs, Oncostatin M, Dexamethasone, Follistatin en hepatocyte growth factor (HGF) een rol, waardoor uiteindelijk hepatocyten worden verkregen die in staat zijn de multiple hepatische functies uit te oefenen: productie en secretie van gal, opname van galzouten, metabolisatie van suikers, vetten en eiwitten, detoxificatie van afbraakproducten en geneesmiddelen, conjugatie van bilirubin, synthese van proteïnen (albumine, alfa-1-antitrypsine, pre-albumine, coagulatiefactoren) enz.Methodes. Ongedifferentieerde rMAPC worden in in cultuur gehouden aan lage celdensiteit en in de aanwezigheid van expansiemedium, ondermeer bestaande uit Leukemia inhibitory factor, 2% fetaal kalf serum, 5x10-8M dexamethasone en de groeifactoren, EGF en PDGF). Bij het opstarten van een hepatische differentiatie, worden rMAPC getrypsiniseerd en aan 50.000 cellen/cm2 in met Matrigel (2%) bedekte cultuurplaten gebracht. Na ~ 16 uur wordt het expansiemedium vervangen door differentiatiemedium, gesupplementeerd met lever-specifieke recombinante cytokines. Het differentiatiemedium bevat, in tegenstelling tot het expansiemedium, 10-6M dexamethasone, geen FCS, geen EGF/PDGF en geen LIF. De concentratie en combinatie van de gebruikte cytokines zijn: d0-6: 100 ng/ml Activin-A en 50 ng/ml Wnt3a; d6-10: 10 ng/ml FGF2 en 50 ng/ml BMP4; d10-14: 50 ng/ml FGF1, 10 ng/ml FGF4 en 25 ng/ml FGF8b; d14-21: 20 ng/ml HGF en 100 ng/ml Follistatin-288.Resultaten.1.Het in vitro hepatisch differentiatie protocol werd na uittesten van verschillende recombinante cytokines aan verschillende concentraties, combinaties en chronologie, verfijnd tot uiteindelijk een 4-staps differentiatie protocol werd verkregen.1.1.Door blootstelling van rMAPC aan Activin-A en Wnt3a, factoren die in vivo belangrijk zijn tijdens gastrulatie, was er een transiënte opregulatie van definitief mesendodermale genen en in mindere mate van primitief endodermale markers. Dit betekent dus dat cellen met extra-embryonale kenmerken toch nog kunnen differentiëren tot definitief endoderm, mits blootstelling aan de gepaste factoren.1.2.Op het einde van de hepatische differentiatie die 20 dagen duurt, werden hepatocyt-achtige celtypes verkregen, zoals blijkt uit een gradueel toenemende expressie van een groot aantal mature hepatische genen op mRNA niveau, uit de secretie van albumine in het geconditioneerd medium, en uit glycogeen stapeling, conjugatie van ongeconjugeerd bilirubine tot bilirubine monoglucuronide en uit synthese van ureum. De eerste stap van het differentiatie protocol (Activin-A/Wnt3a) bleek de meest determinerende stap om een efficiënte vorming van definitief mesendoderm alsook een doorgedreven hepatische maturatie te bekomen.1.3.Om een idee te hebben van de maturatie graad van de hepatocyt-achtige cellen gedifferentieerd vanuit rMAPC, werden definitief endoderm en foetaal leverweefsel op verschillende tijdstippen gepreleveerd van een rat embryo. Op basis van deze gegevens werd aangetoond dat na volledig differentiatie van rMAPC, hepatocyt-achtige cellen van verschillende stadia van maturatie bekomen worden, maar dat de meeste cellen vermoedelijk corresponderen met bipotentiële hepatoblasten. Daarnaast zijn er ook aanwijzingen voor de persisterende aanwezigheid van primitief endoderm.1.4.Naast expressie van hepatische genen, was er ook een opregulatie van mesodermale genen. Vermoedelijk kan de aanwezigheid van andere celtypes ook een positief effect uitoefenen op de hepatisch gespecifieerde celtypes, gezien multiple cel-cel interacties ook in vivo zeer belangrijk zijn voor de celmaturatie.1.5.Zoals verwacht, werd er tijdens de differentiatie een verminderde expressie van Oct4 vastgesteld, waardoor de gedifferentieerde cellen veel minder aanleiding geven tot de vorming van tumorale letsels na subcutane injectie bij immunodeficiënte muizen.1.6.Er bestaat ook een rMAPC cellijn, die Oct4 in veel mindere mate exprimeert. De hepatische differentiatie van deze cellijn was echter veel minder efficiënt, wanneer deze rMAPC werd blootgesteld aan hetzelfde 4-stap differentiatie protocol.2.Bipotentiële hepatoblasten differentiëren ofwel naar mature hepatocyten ofwel naar terminaal gedifferentieerde cholangiocyten. Deze finale differentiatie stap wordt ondermeer bepaald door de TGF-beta en Notch2/Jagged1 pathway. Het effect van inhibitie van deze pathways werd nagekeken. Deze inhibitie werd geïnduceerd door toevoegen van een Notch2-inhibitor (gamma-secretase inhibitor), een TGFbeta-inhibitor (Decorin) of een Activin-A inhibitor (Follistatin-288). Ondanks toevoeging van deze factoren, was er geen duidelijke toename in hepatische maturatie van de rMAPC-gederiveerde cellen. Nochtans moet erop gewezen worden dat het toevoegen van de gamma-secretase inhibitor geen noemenswaardig effect had op de expressie van genen downstream van Notch. Factoren zoals dexamethose, glucagon, insuline en glucose hebben een grote impact op de activatie van mature hepatische genen, die belangrijk zijn voor de uitgebreide metabole functies (gluconeogenesis, glycolysis, glycogeen synthese en afbraak) van de lever. Differentiatie in de afwezigheid van dexamethasone resulteerde in significant lagere expressie van corticosteroid-dependente genen, zoals albumine en tyrosine aminotransferase. Na additie van glucagon was er verhoogde expressie van phosphoenolpyruvate carboxykinase en glucose-6-phosphatase. Tenslotte bleek ook de toevoeging van hoge concentraties glucose (4500 mg/l) een positief effect te hebben op de expressie van enkele genen, zoals deze die coderen voor de synthese van glucose-6-phosphatase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, alpha-1-antitrypsine en albumine.3.Van embryonale stamcellen is geweten dat er een spontane differentiatie naar celtypes met karakteristieken van endoderm, mesoderm en ectoderm optreedt indien er embryonale lichaampjes (dense celklusters) worden gevormd in de afwezigheid van LIF of andere factoren die pluripotentie in standhouden. Om deze spontane differentiatie na te gaan, werden rMAPC in dezelfde omstandigheden gedifferentieerd als hoger beschreven, maar zonder additie van de lever-specifieke cytokines. Zoals verwacht, leidde dit tot verminderde inductie van mesendoderm in het begin van de differentiatie en tot inferieure hepatische maturatie op het einde van de differentiatie. Nochtans waren alle hepatische genen in hogere mate geëxprimeerd in vergelijking met de ongedifferentieerde rMAPC, wat erop wijst dat spontane differentiatie toch in zekere mate plaatsvond. In deze opstelling werd er echter geen albumine gesecreteerd in het medium.Hepatische differentiatie van andere types pluripotente stamcellenOm de bruikbaarheid van het differentiatie protocol, dat ontwikkeld werd voor rMAPC, te verbreden, werd aangetoond dat bovenvermeld 4-staps differentiatie protocol ook kan aangewend worden voor de hepatische differentiatie van mMAPC, voor muis en humane embryonale stamcellen, en voor muis en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, waarbij initieel transiënt mesendoderm wordt gevormd (behalve voor mMAPC), gevolgd door hepatische differentiatie. In tegenstelling tot rMAPC-1, zijn mESC echter veel meer onderhevig aan spontane differentiatie zowel bij differentiatie in 2 als 3-dimensionele structuren. Voor hepatische differentiatie van muis-gederiveerde cellen (MAPC, embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen) is een verlengde differentiatie periode nodig om een gelijkaardige mate van maturatie te bekomen. Voor differentiatie van mMAPC werd één stap van het 4-staps differentiatie protocol geëlimineerd, terwijl voor alle andere celtypes de cytokines aan een zelfde combinatie, concentratie en chronologie werden gebruikt. Het belangrijkste verschil bestond uit de hoeveelheid serum en initiële celdensiteit. Enkel rMAPC konden gedifferentieerd worden in volledige afwezigheid van serum. MAPC werd initieel uitgezet aan hoge celdensiteit, terwijl hepatische differentiatie van embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen startte aan een lage densiteit.ConclusieWe kunnen concluderen dat voldaan werd aan het doel van deze studie om een hepatisch differentiatie protocol te creëeren dat sterk gelijk loopt aan de embryonale leverontwikkeling, waarbij eerst mesendoderm den definitief endoderm gevormd werd, gevolgd door graduele functionele hepatische maturatie.Toekomstig onderzoekMAPC zijn, zoals vermeld, vermoedelijk het resultaat van kweek geïnduceerde reprogrammering, en dus zal het uitermate belangrijk zijn om meer inzicht te krijgen in de manier waarop we dit proces kunnen leiden om zo, op een soliede wijze, isolatie van cellen met een MAPC phenotype te kunnen herhalen, zonder gebruik te maken van genetische manipulatie zoals wel nodig is voor de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen.Hoewel heel wat cytokines en overige factoren werden getest op hun hepatisch inucerende capaciteit, kan de in vitro hepatische differentiatie vermoedelijk nog verder verbeterd worden, en meer gespecifieerd worden volgens het specifiek pluripotent celtype. Dit zou bijvoorbeeld kunnen door verder in te grijpen op de finale differentiatie van hepatoblast-achtige cellen tot ofwel hepatocyten of cholangiocyten, of door de cellen in meer fysiologische 3-dimensionele structuren te kweken. Deze cellen zullen dan verder functioneel gekarakteriseerd worden. Zoals vermeld, bestaat de finale gedifferentieerde celpopulatie uit een heterogene groep celtypes. Momenteel zijn we bezig met het ontwikkelen van strategieën om de verschillende celtypes van elkaar te isoleren.Uiteraard bestaat het ultieme doel van stamcelonderzoek uit het gebruik van stamcel-gederiveerde cellen in regeneratieve geneeskunde. Hiertoe zijn we begonnen om de repopulerende capacteit van hepatocyt-achtige cellen te bestuderen na transplantatie in verschillende dierenmodellen van leverfalen (Fah-model, Jo2-model). Deze experimenten omhelzen natuurlijk ook het nagaan van potentiële nevenwerkingen, het uitsluiten van tumorigenesis van de getransplanteerde cellen, de beste toegangsweg (intrasplenisch, intraportaal, intrahepatisch) en de immunologische aspecten van allogene transplantatie van stamcellen.Hoewel we reeds veel begrijpen van de complexe aspecten van pluripotentie en celdifferentiatie, is er nog heel wat ruimte voor verbetering en is het duidelijk dat het uitvoeren van deze plannen nog veel tijd in beslag zal nemen. Op dit ogenblik is het dan ook onmogelijk om te voorspellen wanneer we de stap naar specifieke toepassingen, hetzij in de farmaceutische industrie, hetzij in de kliniek als bio-artificiële levertoestellen of hopelijk ook voor cel-gebaseerde therapie voor leverlijden zullen kunnen maken.
Publication status: published
KU Leuven publication type: TH
Appears in Collections:Hepatology
Interdepartemental Stem Cell Institute (-)

Files in This Item:

There are no files associated with this item.

Request a copy

 




All items in Lirias are protected by copyright, with all rights reserved.